पारंपरिक मानव Pluripotent के रासायनिक पुनः संस्करण स्टेम कोशिकाओं में सुधार Multilineage भेदभाव शक्ति के साथ एक भोली की तरह राज्य
Summary
हम कुशल, थोक, और पारंपरिक वंश के तेजी से रासायनिक पुनः संस्करण के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान-मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) एक epigenomically में स्थिर भोली आरोपण epiblast-pluripotent राज्य की तरह । इस विधि में कमी हुई वंश में परिणाम-जीन अभिव्यक्ति और पारंपरिक hPSC लाइनों की एक व्यापक प्रदर्शनों की प्रक्रिया के पार निर्देशित multilineage भेदभाव में चिह्नित सुधार ।
Abstract
बेहतर कार्यक्षमता के साथ भोली मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं (एन hPSC) अपक्षयी दवा में एक व्यापक प्रभाव हो सकता है । इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को कुशलतापूर्वक वापस वंश-प्रधान, पारंपरिक मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) या तो फीडर पर बनाए रखा है मुक्त या फीडर पर निर्भर परिस्थितियों में सुधार की कार्यक्षमता के साथ एक भोली की तरह pluripotency । इस रासायनिक भोली reversion विधि शास्त्रीय ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (लिफ), GSK3β, और खल्क/ERK निषेध कॉकटेल (लिफ-2i), केवल एक tankyrase अवरोध करनेवाला XAV939 (लिफ-3i) के साथ पूरक कार्यरत हैं । लिफ-3i जैव रासायनिक, transcriptional, और मानव पूर्व आरोपण epigenetic की epiblast सुविधाओं को अपनाने के लिए एक स्थिर pluripotent राज्य को पारंपरिक hPSC वापस आ जाता है । इस लिफ-3i विधि ंयूनतम सेल संस्कृति हेरफेर की आवश्यकता है और मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) और transgene मुक्त मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) लाइनों की एक व्यापक प्रदर्शन की प्रक्रिया में अत्यधिक reproducible है । लिफ-3i विधि एक फिर से भड़काना कदम से पहले भेदभाव की आवश्यकता नहीं है; N-hPSC सीधे अत्यंत उच्च क्षमता के साथ विभेदित किया जा सकता है और बनाए रखने karyotypic और epigenomic stabilities (सहित पर अंकित loci) । विधि की सार्वभौमिकता में वृद्धि करने के लिए, परम्परागत hPSC पहले दो अतिरिक्त छोटे अणुओं के साथ पूरक लिफ-3i कॉकटेल में कल्चरित होते हैं जो शक्ति प्रदान प्रोटीन कळेनासे ए (forskolin) और सोनिक हेज (श्श्श) (purmorphamine) सिग्नलिंग (लिफ-5i) होते हैं । इस संक्षिप्त लिफ-5i अनुकूलन कदम काफी पारंपरिक hPSC के प्रारंभिक क्लोनिंग विस्तार को बढ़ाता है और उंहें बाद में भोली-लिफ के साथ वापस आ गया है, भारी मात्रा में अकेले 3i, इस प्रकार खरीदना/उपक्लोनिंग दुर्लभ N-obviating की आवश्यकता के लिए अनुमति hPSC बाद में कालोनियां । लिफ-5i-स्थिर hPSCs के बाद लिफ-3i में अकेले विरोधी अपोप्तोटिक अणुओं की आवश्यकता के बिना बनाए रखा जाता है । सबसे महत्वपूर्ण बात, लिफ-3i reversion के रूप में स्पष्ट रूप से उनके वंश को कम करने से पारंपरिक hPSC की एक व्यापक प्रदर्शनों की कार्यक्षमताओं के कार्यात्मक pluripotency में सुधार-प्रधानमंत्री जीन अभिव्यक्ति और निर्देशित भिंनता की पंक्ति परिवर्तनशीलता मिटा सामांयतः स्वतंत्र hPSC लाइनों के बीच मनाया । लिफ के प्रतिनिधि characterizations-3i-वापस आ एन hPSC प्रदान की जाती हैं, और वंश में isogenic hPSC के कार्यात्मक तुलना के लिए प्रयोगात्मक रणनीति- बनामप्रधानमंत्री भोले-भाले राज्यों की तरह रेखांकित होते हैं.
Introduction
2i (खल्क/ERK और GSK3β अवरोधक) संस्कृति प्रणाली मूलतः विषम सीरम-आधारित माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को परिष्कृत करने के लिए विकसित किया गया था (mESC) pluripotency के एक समान जमीन राज्य के लिए संस्कृतियों जैसा माउस आरोपण epiblast1। हालांकि, 2i मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC) लाइनों2के स्थिर रखरखाव का समर्थन नहीं करता है । विभिंन जटिल छोटे अणु, विकास फैक्टर-पूरक है, और ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण हाल ही में putatively समान मानव पर कब्जा करने की सूचना दी गई है pluripotent आणविक राज्यों2की तरह । हालांकि, इन तरीकों के साथ बनाया “भोली की तरह” राज्यों में भी karyotypic अस्थिरता, epigenomic दोषों (जैसे, माता पिता का जीनोमिक के वैश्विक नुकसान का प्रदर्शन), या बिगड़ा भेदभाव की क्षमता के कई ।
इसके विपरीत, GSK3β, ERK और tankyrase संकेतन और ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक के ट्रिपल रासायनिक निषेध की कॉकटेल (लिफ-3i) पारंपरिक hPSC लाइनों3की एक व्यापक प्रदर्शनों की तरह स्थिर भोली-पुनः संस्करण के लिए पर्याप्त था । लिफ-3i-लौट भोली hPSC (एन hPSC) ने सामान्य karyotypes बनाए रखा और भोली-विशिष्ट मानव आरोपण epiblast जीन (जैसे, NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, स्टेला (DPPA3), KLF17 के उनके भाव बढ़ गए , TFCP2L1) । लिफ-3i पुनः संस्करण भी hPSC आणविक और जैव रासायनिक विशेषताओं की एक सरणी mESC के लिए अद्वितीय की तरह भोली pluripotency है कि वृद्धि हुई phosphorylated STAT3 संकेतन शामिल है, कम ERK फास्फारिलीकरण, ग्लोबल 5-methylcytosine CpG विशिष्ट जीन प्रमोटरों, और प्रमुख बाहर OCT4 बढ़ाने के उपयोग-भ्रूण स्टेम सेल (ESC) पर hypomethylation, जीनोम चौड़ा CpG इसके अलावा, अंय भोली reversion तरीकों की तुलना में है कि aberrantly hypomethylated अंकित जीनोमिक loci के परिणामस्वरूप, लिफ-3i-वापस आ N-hPSC अंकित CpG पैटर्न या डीएनए methyltransferase अभिव्यक्ति की हानि के व्यवस्थित नुकसान से रहित थे (जैसे, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.
एक प्रत्यक्ष लिफ पारंपरिक मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) या तो भक्षण या E8 फीडर मुक्त शर्तों पर हो एक व्यापक सरणी के 3i संस्कृति तेजी से और थोक एक भोली epiblast के लिए पुनः संस्करण हासिल की तरह राज्य । हालांकि, प्रत्यक्ष लिफ-3i भोली पुनः संस्करण अंतर्निहित जीनोमिक और वंश-आनुवंशिक रूप से विविध दाता पृष्ठभूमि से उत्पंन variabilities के कारण कुछ अस्थिर पारंपरिक hPSC लाइनों में अक्षम हो सकता है ।
इस प्रकार, लिफ-3i विधि की उपयोगिता को व्यापक करने के लिए, एक stepwise अनुकूलन विकसित किया गया था और यहां प्रस्तुत किया है, कि लगभग किसी भी पारंपरिक hESC या transgene के साथ सार्वभौमिक भोली पुनः संस्करण की अनुमति देता है मुक्त hiPSC लाइन भक्षण पर संस्कृति । इस सार्वभौमिक भोली reversion विधि पारंपरिक hPSC में एक क्षणिक प्रारंभिक संस्कृति कदम है कि दो अतिरिक्त छोटे अणुओं (लिफ-5i) कि शक्ति प्रदान प्रोटीन कळेनासे एक (forskolin) और ध्वनि हेज हॉग (श्श्श) के साथ लिफ-3i कॉकटेल की खुराक को रोजगार ( purmorphamine) सिगनलिंग. लिफ में पारंपरिक hPSC के एक प्रारंभिक बीतने-5i उन्हें भारी मात्रा में बाद में स्थिर लिफ-3i reversion करने के लिए अनुकूल है । प्रारंभिक लिफ-5i अनुकूलन काफी पारंपरिक E8 या भक्षण पर बड़े hPSC के प्रारंभिक एकल कोशिका क्लोनिंग प्रसार वृद्धि (उनके बाद स्थिर, लिफ में निरंतर बीतने-3i अकेले) से पहले । पारंपरिक hPSC लाइनों लिफ में एक मार्ग के लिए पहली बार अनुकूलित-5i बर्दाश्त बाद में लिफ-3i शर्तों, जो उठा और दुर्लभ स्थिर कालोनियों, या के नियमित उपयोग के उपक्लोनिंग के लिए की जरूरत obviates में भोली-लौट कोशिकाओं के बाद थोक क्लोनी passaging विरोधी अपोप्तोटिक अणु या Rho-जुड़े प्रोटीन कळेनासे (रॉक) अवरोधकों ।
लिफ-3i विधि सफलतापूर्वक किया गया है के लिए छुरा का विस्तार और बनाए रखने के लिए > 30 स्वतंत्र, आनुवंशिक रूप से विविध पारंपरिक hPSC लाइनों के लिए > 10-30 या तो गैर-एंजाइमी या एंजाइमी पृथक्करण तरीकों का उपयोग कर मार्ग, और गुणसूत्र या epigenomic विषमताओं के प्रेरण जीन loci में विषमता सहित, के सबूत के बिना । इसके अतिरिक्त, अनुक्रमिक लिफ-5i/लिफ-3i संस्कृति ही भोली reversion विधि है कि इस प्रकार अभी तक सूचित किया गया है कि उनके वंश के कम से पारंपरिक pluripotency लाइनों की एक व्यापक प्रदर्शनों की प्रक्रिया के कार्यात्मक hPSC में सुधार है प्रधानमंत्री जीन अभिव्यक्ति और नाटकीय रूप से उनके multipotent विभेद शक्ति में सुधार । लिफ-3i भोली पुनः संस्करण विधि वंश के विभेद की अंतर्निहित पंक्ति परिवर्तनशीलता-प्रधानमंत्री, पारंपरिक hPSC लाइनों को मिटाता है, और अपक्षयी चिकित्सा और सेलुलर चिकित्सा में आवेदन के एक महान उपयोगिता होगी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
लिफ-3i प्रणाली मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं को क्लासिक murine 2i भोली पुनः संस्करण कॉकटेल1 का एक संशोधित संस्करण लागू होता है । hPSC के स्व-नवीकरण (जो अकेले 2i में विस्तार नहीं कर सकते हैं) tankyrase अवरोधक XAV939 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था/नेि (R01EY023962), NIH/niched (R01HD082098), रपब स्टीन अभिनव पुरस्कार, मैरीलैंड स्टेम सेल अनुसंधान कोष (२०१८-MSCRFV-४०४८, २०१४-MSCRFE-०७४२), नोवो Nordisk विज्ञान फोरम पुरस्कार, और Moseley फाउंडेशन ।
Materials
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 100-18B | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human LIF | Peprotech | 300-05 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-05 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Stemolecule Y27632 in Solution | Stemgent | 04-0012-02 | ROCK inhibitor in solution (10mM) |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A11105-01 | |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Sigma Aldrich | S6402 | use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 | Peprotech | 100-21 | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| Vitronectin XF matrix | StemCell Technologies | 7180 | dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer |
| XAV939 | Sigma Aldrich | X3004 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | light sensitive |
Referências
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