MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ
Summary
micro-RNAs (miRNAs) son cortas y altamente homólogas secuencias de ARN, que sirven como reguladores post-transcripcionales de mensajero RNAs (mRNAs). Los métodos actuales de detección de miRNA varían en sensibilidad y especificidad. Se describe un protocolo que combina en situ el hibridación y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón.
Abstract
micro-RNAs (miRNAs) son transcritos de RNA monocatenario que se unen a mensajero RNAs (mRNAs) e inhiben su traducción o promoción su degradación. Hasta la fecha, miRNAs se han implicado en un gran número de procesos biológicos y enfermedad, que ha significado la necesidad de los métodos de detección fiable de las transcripciones de miRNA. Aquí, describimos un protocolo detallado para marcado con digoxigenina ácido nucleico bloqueado (DIG) (LNA) basada en sondeos miRNA detección, combinada con la proteína immunostaining en secciones de corazón de ratón. En primer lugar, realizamos una técnica de hibridación en situ utilizando la sonda para identificar la expresión del miRNA-182 en las secciones de centro de control y los ratones de la hipertrofia cardiaca. A continuación, realizamos immunostaining para la proteína troponina T (cTnT) cardiaca, en las mismas secciones, localizar Co miRNA-182 con las células de cardiomiocitos. Mediante este protocolo, hemos podido detectar miRNA-182 por una fosfatasa alcalina a base de ensayo colorimétrico y reposo mediante tinción fluorescente. Este protocolo se puede utilizar para detectar la expresión de cualquier miRNA de interés mediante sondas LNA marcada con DIG y expresión de la proteína correspondiente en secciones de tejido de corazón de ratón.
Introduction
son micro-RNAs (miRNAs) corto (18 – 25 nucleótidos), ARN monocatenario, los que funcionan como reguladores negativos de la expresión génica a nivel post-transcripcional por inhibición de la traducción del ARN mensajero (ARNm) o promover la degradación del mRNA 1. miRNAs se transcriben intrones o exones de codificación o los genes y son troceados en el núcleo por DROSHA, miRNAs del precursor (pre-miRNAs), que son estructuras de corto lazo del vástago de 70 nucleótidos2. Después citoplásmica de la exportación, pre-miRNAs más son procesados por DICER en miRNAs maduros que abarcan 18 – 25 nucleótidos3,4. Posteriormente, el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) incorpora estos miRNAs como ARN monocatenario, que permite su unión a la región 3′ no traducida (3′-UTR) de sus mRNAs de destino para reprimir su expresión3,5 .
En las últimas tres décadas, puesto que primero fueron identificados, miRNAs han surgido para principales reguladores de la expresión génica, cuyos niveles de expresión están estrechamente controlados6. Papeles de miRNAs se han descrito en órgano desarrollo7,8,9,10,11,12, mantenimiento de la homeostasis13,14 , así como de contextos de enfermedad que incluyen neurológica15,16,17,18,19, cardiovascular20, condiciones autoinmunes21 ,22,23,de cáncer24y otros25. La apreciación creciente de la importancia de los patrones de expresión de miRNA ha presentado la necesidad de métodos de detección fiable de las transcripciones de miRNA. Tales métodos incluyen PCR de tiempo Real, microarrays, norte Blot, hibridación en situ y otros, que varían en sensibilidad, especificidad y potencia cuantitativa, predominante debido a que miRNA transcripciones se componen de corto y secuencias altamente homólogo6.
Nos informó recientemente un papel importante de miRNA-182 en el desarrollo de la hipertrofia del miocardio26, una condición que describe la adaptación estructural del corazón en respuesta a elevadas exigencias hemodinámicas27,28. Hipertrofia cardiaca se caracteriza por el aumento de la masa miocárdica, que, si asociado con remodelación desadaptativas29, puede llevar a un mayor riesgo para la insuficiencia cardíaca, una condición representan 8.5% de todas las muertes atribuibles a cardiovascular enfermedad30.
Aquí, describimos nuestro protocolo que combina en situ el hibridación con una sonda de ácido nucleico bloqueado (DIG) (LNA) y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón, marcados con digoxigenina en nuestro modelo de la hipertrofia cardiaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
detección de transcripción miRNA puede lograrse a través de diferentes técnicas que varían en sensibilidad, especificidad y potencia cuantitativa. Aquí, demostramos el acoplamiento de miRNA en situ hibridación con inmunotinción y describe un protocolo que permite la evaluación simultánea de los niveles de expresión de moléculas de proteína y miRNA, en las mismas secciones de corazón. Primero mostramos cómo realizar en situ hibridación de sondas de miRNA LNA marcada con DIG en las seccion…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Athanasios Papangelis, por comentarios críticos sobre el manuscrito. FM es apoyado por la biotecnología y el Consejo de investigación de ciencias biológicas (BBSRC; BB/M009424/1). IP se apoya en el corazón Americano Asociación científico desarrollo Grant (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
Referências
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