Ткани конкретных Мирна выражение профилирования в мыши сердца с помощью секции гибридизации In Situ
Summary
микро РНК (интерферирующим) являются короткие и очень гомологичных последовательности РНК, выступающей в качестве post-transcriptional регуляторы messenger РНК (мРНК). Текущие методы обнаружения Мирна различаются по чувствительности и специфичности. Мы описываем протокол, который сочетает в себе в situ Гибридизация и иммуноокрашивания для одновременного обнаружения Мирна и белковых молекул на разделах ткани сердца мыши.
Abstract
микро РНК (интерферирующим) являются одноцепочечной РНК стенограмм, которые привязку к messenger РНК (мРНК) и препятствовать их перевода или содействовать их деградации. На сегодняшний день, адаптивной были причастны большое количество болезней и биологических процессов, который означало необходимость надежного обнаружения методов Мирна стенограмм. Здесь мы описываем подробный протокол для digoxigenin меченых (DIG) Locked нуклеиновой кислоты (LNA) на основе выборки Мирна обнаружения, в сочетании с иммуноокрашивания белка на мыши сердце секций. Во-первых мы провели в situ гибридизация технику с помощью зонда для определения Мирна-182 выражение в разделах сердца от управления и гипертрофии сердца мышей. Далее мы провели иммуноокрашивания для сердца тропонина T (cTnT) белка, на те же разделы, совместно локализовать Мирна-182 с клетки cardiomyocyte. Используя этот протокол, мы смогли обнаружить основанный Мирна-182 через щелочной фосфатазы колориметрические пробирного и cTnT через флуоресцентной окраски. Этот протокол может использоваться для обнаружения выражение любого Мирна интерес через DIG-меченых LNA зонды и соответствующих белков на разделах ткани сердца мыши.
Introduction
микро РНК (интерферирующим) являются короткие (18-25 нуклеотидов), одноцепочечной, некодирующей РНК, которые функционируют как негативные регуляторы экспрессии генов на post-transcriptional уровне путем ингибирования матричная РНК (мРНК) перевод и/или содействия деградации мРНК 1. интерферирующим расшифрованный от интронов или экзонов кодирования или некодирующей генов и являются расщепляется в ядре, DROSHA, чтобы прекурсоров интерферирующим (pre адаптивной), которые являются короткий стебель циклические структуры 70 нуклеотидов2. После цитоплазматических экспорта, pre адаптивной Далее перерабатывается DICER в зрелых адаптивной, которые охватывают 18-25 нуклеотидов3,4. Впоследствии РНК-комплекс (RISC) включает в себя эти интерферирующим как одноцепочечной РНК, которая позволяет для их привязки к 3′ непереведенные региона (3′-УТР) их целевых мРНК подавить их выражение3,5 .
В течение последних трех десятилетий так как они впервые были определены, адаптивной появились мастер регуляторы экспрессии генов, чьи собственные уровни выражения являются жестко контролируемой6. Роли для адаптивной были описаны в орган развития7,8,9,10,11,12, поддержание гомеостаза13,14 , а также болезни контексты, которые включают неврологические15,16,,1718,19, сердечно-20, аутоиммунных условия21 ,22, рака23,24и другие25. Увеличение признательность за актуальность структур Мирна выражение выдвинули необходимость надежного обнаружения методов Мирна стенограмм. Такие методы включают реальном масштабе времени PCR, microarrays, Северный Blotting, в situ Гибридизация и другие, которые различаются в чувствительность, специфичность и количественные власти, преимущественно с тем, что Мирна стенограммы состоят из коротких и 6высоко гомологичных последовательности.
Недавно мы сообщили важную роль для Мирна-182 в развитие гипертрофии миокарда26, условие, описывая структурной адаптации сердца в ответ на повышенный гемодинамики требования27,28. Гипертрофии сердца характерно увеличение массы миокарда, который, если связанные с неадаптивные ремоделирования29, может привести к повышенному риску развития сердечной недостаточности, условие, приходится 8,5% всех смертей объясняется сердечно-сосудистой системы болезни30.
Здесь мы описываем наш протокол, который сочетает в себе в situ гибридизация с надписью digoxigenin (DIG) Locked нуклеиновой кислоты (LNA) зонд и иммуноокрашивания для одновременного обнаружения Мирна и белковых молекул на разделах ткани сердца мыши, в нашем модель гипертрофии сердца.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мирна Стенограмма обнаружения может быть достигнуто через различные методы, которые варьируются в чувствительность, специфичность и количественные власти. Здесь, мы демонстрируем муфта микроРНК в situ гибридизация с иммуноокрашивания и описать протокол, который позволяет для пар?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Атанасиоса Papangelis, за критические замечания по рукописи. FM поддерживается биотехнологии и биологических наук научно-исследовательский совет (СИББН; BB/M009424/1). IP поддерживается грант развития ассоциации ученый американского сердца (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
Referências
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
- Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
- Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
- Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
- Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
- Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
- Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
- Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
- Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
- Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
- Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
- Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
- Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
- Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
- O’Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
- Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
- He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
- Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
- Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
- Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
- Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).
