Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ
Summary
micro-RNAs (miRNAs) são sequências de RNA curtas e altamente homólogas, servindo como reguladores pós-transcricional de RNAs mensageiro (mRNAs). Métodos de deteção de miRNA atuais variam em sensibilidade e especificidade. Descreveremos um protocolo que combina a hibridação in situ e imunocoloração para a deteção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato.
Abstract
micro-RNAs (miRNAs) são transcrições de single-stranded RNA que se ligam ao RNA mensageiro (mRNAs) e inibem a sua tradução ou promovem a sua degradação. Até à data, os miRNAs têm sido implicados em um grande número de processos biológicos e doença, que tem representado a necessidade para os métodos de detecção confiável de miRNA transcrições. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para Digoxigenina-rotulado (escavação) trancado ácido nucleico (LNA) baseada em investigação miRNA deteção, combinada com proteína immunostaining em seções de coração de rato. Primeiro, realizamos uma técnica hibridização em situ utilizando a sonda para identificar miRNA-182 expressão nas seções de coração de controle e os ratos de hipertrofia cardíaca. Em seguida, realizamos imunocoloração para proteína cardíaca de troponina T (miocardite), sobre as mesmas seções, co localizar miRNA-182 com as células de casos. Usando este protocolo, fomos capazes de detectar miRNA-182 através uma fosfatase alcalina baseado ensaio colorimetric e miocardite através de coloração fluorescente. Este protocolo pode ser usado para detectar a expressão de qualquer miRNA de interesse através das sondas LNA escavar-etiquetadas e expressão de proteínas relevantes em cortes de tecido de coração de rato.
Introduction
micro-RNAs (miRNAs) são curtas (18-25 nucleotides), RNAs single-stranded, não codificante que funcionam como reguladores negativos da expressão génica a nível pós-transcricional por inibição da tradução do RNA mensageiro (mRNA) e/ou promover a degradação do mRNA 1. os miRNAs são transcritas de intrões ou exões de codificação ou não-codificante genes e são clivadas no núcleo por DROSHA, que os miRNAs precursor (pre-miRNAs), que são estruturas de Hairpin loop curto de 70 nucleotídeos2. Seguindo citoplasmática de exportação, pré-miRNAs são subsequentemente transformados por DICER em miRNAs maduros que abrangem 18-25 nucleotides3,4. Posteriormente, o complexo silencioso induzido por RNA (RISC) incorpora estes miRNAs como single-stranded RNA, que permite a sua ligação à 3′ untranslated região (3′-UTR) dos seus mRNAs alvo para suprimir sua expressão3,5 .
Dentro nas últimas três décadas, desde que eles foram primeiramente identificados, miRNAs surgiram para mestre reguladores da expressão do gene, cujos níveis de expressão são rigidamente controlada6. Funções para os miRNAs têm sido descritas em órgão desenvolvimento7,8,9,10,11,12, manutenção da homeostase13,14 , bem como os contextos de doença que incluem neurológico15,16,17,18,19, cardiovascular20, doenças auto-imunes21 ,22, cancros23,24e outros25. A crescente valorização para a relevância de padrões de expressão de miRNA apresentou a necessidade de métodos de deteção confiável de miRNA transcrições. Tais métodos incluem PCR em tempo Real, microarrays, mancha do Norte, hibridação in situ e outros, que variam de sensibilidade, especificidade e poder quantitativa, predominantemente, devido ao fato de que miRNA transcrições são compostas de curto e sequências homólogas altamente6.
Recentemente, informou um papel importante no desenvolvimento da hipertrofia miocárdica26, uma condição descrevendo a adaptação estrutural do coração em resposta às elevadas exigências hemodinâmica27,28de miRNA-182. Hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento da massa miocárdica, que, se associado com remodelação mal-adaptativos29, pode levar a aumento do risco de insuficiência cardíaca, uma condição de contabilização de 8,5% de todas as mortes atribuíveis a cardiovascular doença de30.
Aqui, descrevemos nosso protocolo que combina a hibridação in situ com uma sonda de ácido nucleico de bloqueado (escavação) (LNA) Digoxigenina-etiquetadas e imunocoloração para a detecção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato, em nosso modelo de hipertrofia cardíaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
deteção de transcrição de miRNA pode ser conseguida através de técnicas diferentes que variam em sensibilidade, especificidade e poder quantitativa. Aqui, demonstramos o acoplamento de miRNA hibridação in situ com imunocoloração e descrever um protocolo que permite a avaliação simultânea dos níveis de expressão de moléculas miRNA e proteína, sobre as mesmas seções de coração. Nós primeiro mostrar como realizar a hibridação in situ de sondas de miRNA LNA escavar-etiquetadas em se?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer Athanasios Papangelis, comentários críticos sobre o manuscrito. FM é apoiado pela biotecnologia e Conselho de pesquisa de ciências biológicas (BBSRC; BB/M009424/1). IP é suportado pela Associação coração americano cientista desenvolvimento Grant (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
Referências
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
- Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
- Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
- Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
- Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
- Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
- Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
- Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
- Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
- Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
- Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
- Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
- Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
- Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
- O’Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
- Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
- He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
- Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
- Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
- Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
- Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).
