Tissu-spécifique miRNA, profilage de l’Expression à l’aide de la souris coeur Sections en hybridation in Situ
Summary
micro-ARN (miARN) est des séquences d’ARN courts et très homologues, agissant comme organismes de réglementation post-transcriptionnelle des ARN messagers (ARNm). Les méthodes actuelles de détection de miRNA varient dans la sensibilité et la spécificité. Les auteurs décrivent un protocole qui combine l’hybridation in situ et immunostaining pour la détection simultanée de miRNA et protéine molécules sur des sections de tissu cardiaque souris.
Abstract
micro-ARN (miARN) est des transcriptions d’ARN simple brin qui se lient à des ARN messagers (ARNm) et inhibent leur traduction ou promouvoir leur dégradation. A ce jour, les miARN ont été impliqués dans un grand nombre de processus biologiques et la maladie, qui a signifié la nécessité pour les méthodes de détection fiable des transcriptions de miRNA. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour digoxigénine marqués (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) miRNA basée sur sonde détection, combiné avec la protéine immunostaining sur des sections de coeur de souris. Tout d’abord, nous avons réalisé une technique hybridation in situ à l’aide de la sonde pour identifier l’expression miRNA-182 dans les sections de centre de contrôle et de la souris de l’hypertrophie cardiaque. Ensuite, nous avons effectué immunostaining cardiaque protéine troponine T (cTnT), sur les mêmes sections, de localiser co miRNA-182 avec les cellules cardiomyocytes. Utilisant ce protocole, nous avons pu détecter miRNA-182 à travers une phosphatase alcaline selon Dosage colorimétrique et cTnT par coloration fluorescente. Ce protocole peut être utilisé pour détecter l’expression de n’importe quel miRNA d’intérêt au moyen de sondes LNA creuser-étiqueté et expression de la protéine pertinentes sur des sections de tissu cardiaque souris.
Introduction
micro-ARN (miARN) est courts (18 – 25 nucléotides), ARN monocaténaire, non codantes qui fonctionnent comme des régulateurs négatifs de l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel à inhiber la traduction de l’ARN messager (ARNm) et/ou promotion de dégradation de l’ARNm 1. miARN est transcrits d’introns ou des exons du codage ou non codantes des gènes et sont clivés dans le noyau par DROSHA, à précurseur miARN (pré-miARN), qui sont des structures de tige-boucle courte de 70 nucléotides2. Suite cytoplasmique à l’exportation, les pré-miARN est transformés par DICER en miARN matures qui s’étendent sur 18 – 25 nucléotides3,4. Par la suite, le complexe silencieux RNA-induced (RISC) intègre ces miARN comme ARN simple brin, qui permet leur liaison à la région 3′ non traduite (3′-UTR) de leurs ARNm cible pour réprimer leur expression3,5 .
Dans les trois dernières décennies, puisqu’ils ont été d’abord identifiés, miARN ont émergé à maîtres régulateurs de l’expression des gènes, dont les niveaux d’expression sont étroitement contrôlé6. Rôles des miARN ont été décrits à l’orgue développement7,8,9,10,11,12, maintien de l’homéostasie du13,14 , ainsi que des contextes maladie qui incluent neurologiques15,16,17,18,19, cardiovasculaires20, maladies auto-immunes21 ,22et autres cancers23,2425. L’intérêt croissant pour la pertinence des modèles d’expression de miRNA a avancé la nécessité de méthodes de détection fiable des transcriptions de miRNA. Ces méthodes incluent PCR en temps réel, microarrays, Northern blot, hybridation in situ et autres, qui varient dans la sensibilité, la spécificité et la puissance quantitative, principalement dû au fait que miRNA transcriptions sont constituées de courtes et des séquences très homologues6.
Nous avons récemment rapporté un rôle important pour miRNA-182 dans le développement de l’hypertrophie myocardique26, une condition qui décrit l’adaptation structurelle du coeur en réponse aux demandes hémodynamiques élevé27,28. L’hypertrophie cardiaque se caractérise par l’augmentation de la masse myocardique, qui, si associé à retouche inadaptés29, peut conduire à un risque accru d’insuffisance cardiaque, une condition représentaient 8,5 % du total des décès attribuables aux cardiovasculaire 30de la maladie.
Nous décrivons ici notre protocole qui combine hybridation in situ avec une sonde (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) et les immuno-coloration pour la détection simultanée de miRNA et protéine molécules sur des sections de tissu de coeur de souris, digoxigénine marquée dans notre modèle de l’hypertrophie cardiaque.
Protocol
Representative Results
Discussion
détection de transcription de miRNA est possible par le biais de différentes techniques qui varient dans la sensibilité, de spécificité et de puissance quantitative. Ici, nous démontrons l’accouplement de miRNA hybridation in situ avec immunostaining et décrire un protocole qui permet pour évaluer les niveaux d’expression des molécules de miRNA et protéine, sur les mêmes sections de coeur simultanée. Tout d’abord, nous montrons comment faire une hybridation in situ de creuser-étiquet?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Athanasios Papangelis, des observations critiques sur le manuscrit. FM est pris en charge par le Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC ; BB/M009424/1). IP est pris en charge par l’American Heart Association scientifique Development Grant (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
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