Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme
Summary
Kısa antianlamlı oligonucleotides fare beyin bölümlerde alternatif pre-mRNA yapıştırma desenleri algılamak için kullandığı bir in situ hibridizasyon (ISH) protokolü tanımlanır.
Abstract
Alternatif dikişi (AS) insan genlerinin fazla % 90 oluşur. Bir alternatif olarak spliced exon ifade desenini kez bir hücre türüne özgü biçimde düzenlenmiştir. Kalıpları genellikle RT-PCR ve RNA-seq tarafından incelenir ifadesi olarak hücreleri bir popülasyondan RNA numuneleri kullanılarak izole. İn situ incelenmesi belirli bir biyolojik yapısı için ifade desen olarak kullanarak exon özgü probları RNA in situ hibridizasyon tarafından (ISH) yapılabilir. Ancak, alternatif ekzonlar genellikle exon özgü probları tasarlamak için çok kısa olduğu için ISH belirli bu kullanımı sınırlı olmuştur. Bu raporda, BaseScope, RNA ISH, kısa antianlamlı oligonucleotides istihdam son zamanlarda gelişmiş bir teknoloji kullanımı olarak fare beyin bölümleri ifade desenleri analiz etmek için tanımlanır. EXoN 23a nörofibromatozis tip 1 (Nf1) örnek olarak kısa exon-exon junction probları RNA ISH analiz fare beyin bölümlerinde yüksek özgüllük ile sağlam hibridizasyon sinyalleri sergi göstermek için kullanılır. Daha da önemlisi, exon eklenmesi ve atlama-özel probları ile tespit sinyalleri güvenilir değerlerde Nf1 exon 23a ifade bir fare beynin farklı anatomik bölgelerde spliced yüzdesini hesaplamak için kullanılabilir. Deneysel protokol ve hesaplama yöntemi için analiz olarak sunulmaktadır. Sonuçlar BaseScope ifade desenleri in situdeğerlendirmek için güçlü bir yeni araç sağlar gösterir.
Introduction
Alternatif dikişi (AS) pre-mRNA olgunlaşma sırasında oluşan ortak bir süreçtir. Bu süreçte bir exon differentially olgun mRNA dahil edilebilir. Böylece, AS ile bir gen birçok mRNA’ların farklı protein ürünleri için bu kodu oluşturabilirsiniz. Bu tahmin edilmektedir insan genlerinin % 92-94 alternatif dikişi1,2tabi. Anormal alternatif uçbirleştirme desenleri sonuçlandı genetik mutasyonlar hastalıklar, amyotrofik lateral skleroz, miyotonik distrofi ve kanser3,4de dahil olmak üzere çok sayıda bağlantılı. Böylece araştırmak ve alternatif alışılageldik düzenleyici mekanizmaları insan hastalıkların yeni tedaviler bulmak için bir girişim daha iyi anlamak önemlidir.
GİBİ sık sık bir hücre türüne özgü biçimde düzenlenmiştir. Belirli bir biyolojik sisteminin belirli bir gen AS ifade desenini belirlemek önemlidir. Hücreleri, beyin veya kalp, gibi birçok farklı türde içeren karmaşık bir organ okudu ancak bu karmaşık olur. Bu durumda, ideal bir tahlil sisteminin belirli bir gen AS ifade desen birçok hücre tiplerinde aynı anda tespit edilebilir böylece RNA in situ hibridizasyon (ISH) doku kullanarak bölümleri seçimdir. Nitekim, exon özgü probları bir alternatif exon5,6,7‘ nin ifade düzeylerini değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, bu yaklaşım aşağıdaki nedenlerden dolayı iyi desen analiz için uygun değildir. İlk, geleneksel ISH yöntemleri genellikle probları 300’den daha uzun kullanın bp, omurgalı iç ekzonlar (değil ilk veya son exon) ortalama büyüklüğü 170 nükleotit8,9iken. Exon özgü sonda bir iç alternatif exon alışılageldik paterni incelemek için kullanıldığında, ikinci olarak, sondası tarafından algılanan tek mRNA izoformu exon tespit edilemez olmadan, mRNA izoformu ise exon içeren sıradır. Böylece, hesaplama için alternatif exon (PSI) değerindeki spliced yüzde karmaşıktır. Ayrıca, geleneksel floresan ISH kez ISH algılama verimliliği ve sağlamlık azaltan immunostaining ile bir araya getirir. Örneğin, stres kaynaklı araştırıldı bir çalışmada izoformu asetilkolinesteraz (ağrı) geçiş Uçbirleştirme mRNA, digoxigenin ISH sondayı dahil oldu ve anti-digoxigenin antikor kullanarak algılandı. Alternatif olarak, biotin etiketli sonda bir alkali fosfataz/streptavidin eşlenik ve alkalen fosfataz10için bir substrat tarafından tespit edildi. Ben de yöntemi herhangi bir güçlendirme stratejisi algılama hassasiyeti artırmak için kullanılır. Sonuç olarak, düşük seviyelerde ifade edilir mRNA transkript algılamak için meydan okuyor. Böylece, daha basit ve daha sağlam bir ISH tahlil sistem ifade desenleri in situanaliz etmek için gereklidir.
BaseScope son zamanlarda RNAscope, köklü bir platformda temel alınarak geliştirilmiş ve yaygın kullanılan ISH tahlil sistemi. Her iki tahlil sistemleri algılama11,12hassasiyeti artar bir hedef özgü güçlendirme teknolojisi kullanır. Birini diğerinden ayırt eder gibi kısa BaseScope için 50 nukleotid ve 300-1000 nükleotit RNAscope için hedef sırası uzunluğudur. Böylece, belirli alternatif mRNA izoformlarının algılamaya exon exon kavşak hedef tasarım probları mümkündür. Mevcut çalışmada, ifade desenleri nörofibromatozis 1 (Nf1) exon 23a, kapsamlı bir şekilde aynı laboratuvar13,14,15 ‘ te okudu bir alternatif exon yazarken incelemek için bir yordam kuruldu , 16 , 17, fare beyin bölümlerde. Sonuçları BaseScope Nf1 exon 23a içinde in situifade desen çalışması için ideal bir sistem olduğunu ispat. Bu tahlil sistemi gibi birçok alternatif ekzonlar ifade desenleri analiz etmek için adapte edilebilir gibi güçlü bir yeni araç as çalışmalarda temsil eder
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim raporları BaseScope RNA ISH fare beyin bölümleri ifade desenleri olarak incelemek için kullanın. Bu anti-anlamda exon-exon junction 50 nukleotid exon içerme ve sağlam ve özellikle izoformlarının atlama hedefleyebilirsiniz daha kısa probları gösterilmiştir. Ayrıca, elde edilen sinyalleri bir alternatif exon PSI hesaplamak için kullanılabilir.
Birkaç varyasyon yordamda test edildi. Örneğin, donmuş doku bölümleri cryostat kesit tarafından oluşturulan test ve …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser [Grant-in-Aid 0365274B H.L. için], Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenen Ulusal Kanser Enstitüsü [GI SPORE P50CA150964] Z.W. için Ulusal Sağlık Enstitüleri [Office of araştırma altyapı paylaşılan araçları Grant S10RR031845 için Işık mikroskobu] Case Western Reserve Üniversitesi tesisinde görüntüleme ve Çin burs Konseyi’ne [X.G.].
Yazarlar ile slayt tarama ışık mikroskobu Imaging Core için onun yardım etmek içinde Richard Lee teşekkür ederiz.
Materials
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10X Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50X Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific | 12–545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
Referências
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5’UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5’UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?. Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
