RNA原位杂交法定量分析小鼠脑切片中的替代前 mRNA 拼接方法

替代剪接 (AS) 是一个常见的过程中发生的前 mRNA 成熟。在这个过程中, 一个外显子可以是差异包括在成熟的 mRNA。因此, 通过作为, 一个基因可以产生许多基因编码为不同的蛋白质产品。据估计, 人类基因的92–94% 可替代剪接^1,2。基因突变导致的不正常的选择性剪接模式与大量疾病有关, 包括肌萎缩侧索硬化、强直营养不良和癌症^3、4。因此, 调查和更好地了解替代剪接调控机制, 以寻求新的人类疾病治疗, 是至关重要的。

通常是以特定于细胞类型的方式来调节的。确定特定基因在给定生物系统中的表达模式是很重要的。然而, 当一个包含许多不同类型细胞的复杂器官 (如大脑或心脏) 被研究时, 这就变得复杂了。在这种情况下, 一个理想的检测系统的选择是 RNA原位杂交 (用组织切片), 因此, 作为特定基因的表达模式可以在许多细胞类型同时检测。事实上, 外显子特定的探针被用来评估替代外显子^5,6,7的表达水平。但是, 由于以下原因, 这种方法不太适合作为模式分析。首先, 常规的方法通常使用比 300 bp 长的探针, 而脊椎动物内部外显子 (不是第一个或最后一个外显子) 的平均大小是170核苷酸^8,9。其次, 当一个外显子特定探针用于检查内部替代外显子的剪接模式时, 探针检测到的唯一的 mrna 异构体是含有外显子的, 而无外显子的 mrna 异构体无法检测到。因此, 计算替代外显子的 (PSI) 值的拼接百分比是复杂的。此外, 传统的荧光染色通常与多相结合, 降低了检测效率和鲁棒性。例如, 在研究了乙酰胆碱酯酶 (疼痛) mRNA 的应力诱导剪接异构体切换时, 辛被纳入到探头中, 并使用抗辛抗体进行检测。或者, 用碱性磷酸酶/链亲和素共轭和碱性磷酸酶¹⁰的基质检测生物素标记探针。两种方法都不使用任何放大策略来提高检测的灵敏度。因此, 检测在低水平表达的 mRNA 转录是很有挑战性的。因此, 需要一个更简单、更健壮的检测系统来分析原位的表达模式。

BaseScope 是在 RNAscope 的基础上发展起来的, 该平台是一个建立良好、应用广泛的检测系统。两种检测系统都采用目标特定的放大技术, 提高了检测^11、12的灵敏度。区别于另一种的是目标序列的长度, 这是 BaseScope 的50核苷酸, 300–1,000 核苷酸用于 RNAscope。因此, 有可能设计的探针, 目标外显子-显子的连接, 以检测特定的替代 mRNA 亚型。在目前的研究中, 建立了一个程序, 以检查神经纤维瘤1型 (Nf1) 外显子23a 的表达模式, 在同一实验室^13,14,15广泛研究的替代显子。^,16,17、在小鼠脑科。结果表明, BaseScope 是研究Nf1外显子 23a原位表达模式的理想系统。由于该检测系统可以被改编为许多替代外显子的表达模式, 它代表了一个强大的新工具在研究中的作为。