JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Op lange termijn In Vivo Tracking van inflammatoire cel dynamiek binnen Drosophila poppen

Published: June 14, 2018
doi:
10.3791/57871
, , ,
1School of Biochemistry, Biomedical Sciences,University of Bristol, 2School of Cellular and Molecular Medicine, Biomedical Sciences,University of Bristol, 3MRC Centre for Inflammation Research,University of Edinburgh, Queens Medical Research Institute, 4School of Physiology, Pharmacology, and Neuroscience, Biomedical Sciences,University of Bristol

Summary

Hier presenteren we een protocol voor live-imaging wond reparatie en de geassocieerde inflammatoire respons bij hoge spatio-temporele resolutie in vivo. Deze methode maakt gebruik van de popstadium van Drosophila ontwikkeling om op lange termijn beeldvormings- en na verloop van tijd het volgen van specifieke cel populaties en is compatibel met efficiënte RNAi-gemedieerde gene inactivatie.

Abstract

Tijdens de snelle inflammatoire reactie op weefselbeschadiging, worden de cellen van het aangeboren immuunsysteem snel gerekruteerd voor de site van de schade. Eenmaal op de wond, ingeboren immune cellen een aantal essentiële functies, zoals de bestrijding van infectie, necrotisch puin clearing, en het stimuleren van matrix afzetting uitvoeren. Om volledig te begrijpen de uiteenlopende signalering gebeurtenissen die deze immuunrespons regelen, is het van cruciaal belang te observeren van de complexe gedrag van (en interacties die tussen plaatsvinden) meerdere cel lineages in vivo en in real time, met de hoge Spatio-temporele resolutie. De optische doorschijnendheid en de genetische werkwillig van Drosophila embryo’s Drosophila hebben opgericht als een onschatbare waarde model aan live-image en ontleden van fundamentele aspecten van inflammatoire cel gedrag, met inbegrip van mechanismen voor Developmental verspreiding, Goedkeuringvande apoptotic lijken en/of microbiële ziekteverwekkers, en werving voor wonden. Meer recente werk heeft echter nu aangetoond dat een veel later stadium in de levenscyclus van Drosophila – de Drosophila Verpopping-dienst een aantal onmiskenbare voordelen biedt, met inbegrip van verbeterde RNAi efficiëntie, langere periodes, imaging en aanzienlijk meer immuun cel nummers. Hier beschrijven we een protocol voor imaging reparatie van de wond en de geassocieerde inflammatoire respons in de hoge spatio-temporele resolutie in levende Drosophila poppen. Om te volgen de dynamiek van zowel opnieuw epithelialization en ontsteking, gebruiken we een aantal specifieke in vivo fluorescente markeringen voor zowel het epitheel en het aangeboren immuun cellen. We tonen ook de effectiviteit van foto-cabriolet fluorophores, zoals Kaede, voor het volgen van de specifieke immuun cel subsets, om bij te houden van hun gedrag als ze naar migreren, en vastberadenheid uit, de schade-site.

Introduction

Een efficiënte en effectieve inflammatoire respons is cruciaal voor elk organisme te bestrijden van infecties, duidelijk puin en orkestreren van de reparatie van gewonde weefsels1. Hoewel deze reactie een onvermijdelijk resultaat van de meeste weefselschade is, vereist ontsteking strikte regelgeving, omdat een ongepaste inflammatoire respons is gekoppeld aan een verscheidenheid van verschillende ziekten bij de mens (met inbegrip van chronische niet-genezende wonden, overdreven littekenvorming, en aanleg voor kanker)1,2,3. Gezien deze klinische relevantie, is het van cruciaal belang voor een meer gedetailleerd inzicht in de moleculaire en cellulaire mechanismen rijden de ontstekingsreactie teneinde nieuwe voorspellende indicatoren en strategieën voor de behandeling van een aantal chronische inflammatoire voorwaarden op grond waarvan reparatie weefsels tegen langdurige en onnodige ontsteking beschermen kunnen.

In de afgelopen jaren is de Drosophila uitgegroeid tot een gevestigde en waardevolle modelsysteem om te ontleden van de fundamentele kenmerken van de ontstekingsreactie bewaard van insecten tot menselijke4,5. Op dit moment Drosophila biedt veel meer genetische werkwillig dan momenteel mogelijk is in andere experimentele modellen (zoals muizen of zebrafish), toelaat nauwkeurige spatio-temporele genetische manipulatie in vivo (naar de inactivering of over express een gen van belang binnen specifieke celtypes op een gedefinieerde ontwikkelings-tijdstip) en gemak van genoom-brede schermen6,7. Traditioneel, zijn meeste live-imaging studies van wondgenezing en ontstekingen bij Drosophila uitgevoerd in embryonale stadia, zoals embryo’s stilstaan (in tegenstelling tot de Drosophila larven of volwassenen) en zijn optisch doorschijnend waardoor ongekend hoge resolutie in vivo imaging8. Dit heeft toegestaan onderzoekers te visualiseren van de snelle en robuuste werving van Drosophila ingeboren immune cellen (hemocytes) naar de site van de wond in reactie op de mechanische of laser-veroorzaakte schade aan de embryonale epitheel9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. door deze live-imaging studies te combineren met de genetische manipulatie, studies in Drosophila embryo’s vele belangrijke immuun cel eiwitten waarmee inflammatoire cel gedrag in vivohebben ontdekt. Bijvoorbeeld, de CED-1 homolog Draper (een ITAM domein-bevattende eiwit) is geïdentificeerd als een belangrijke “schade receptor” die bemiddelt de aanwerving Drosophila immune cellen in een H2O2-afhankelijke wijze naar sites van 15beschadigen. Draper niveaus binnen immuuncellen worden op zijn beurt weer gereguleerd door calcium-geïnduceerde JNK signalering en verhoogde stroomafwaarts van apoptotic lijk opname12. Hemocyte motiliteit verder vereist complexe cytoskeletal veranderingen te coördineren gestuurde migratie naar de wond en dit is afhankelijk van de activiteit van cytoskeletal regelgevende instanties zoals de actine-bundeling eiwit Fascin16 en de kleine Rho-familie GTPases-Rac en Rho9.

Drosophila is een holometabolous insect dat door de extra larvale en pop stadia na embryogenese gaat, vóór het bereiken van volwassenheid17. De verpopping Drosophila is ontwikkeld als een extra model voor niet-invasieve live-imaging van een verscheidenheid van dynamische cellulaire gebeurtenissen, met inbegrip van ontwikkelingsstoornissen cel migratie18, celdeling19, cel groei20en spier Contractie21. Meer recentelijk is vastgesteld als een nieuwe model voor het bestuderen van de dynamiek van de wond reparatie en ontsteking in vivo22,23.

Net als in de embryonale stadia, Drosophila poppen stilstaan en zijn optisch doorschijnend, na zorgvuldige dissectie van hun ondoorzichtige pop gevallen18. Door te profiteren van deze optische transparantie, kan men de werking in vivo van aangeboren immuuncellen (hemocytes) volgen in reactie op de weefselschade in Drosophila pop weefsels, zoals de pop vleugel22. De pop vleugel bestaat als een eenvoudige bilayered structuur, bestaande uit twee grote platte epitheliale vellen die zijn aangesloten langs de rand van de vleugel; de extracellulaire ruimte tussen deze twee epitheliale lagen is gevuld met Hemolymfe (insect bloed) en grote aantallen motile hemocytes24. Net als in de embryo’s triggert mechanische of laser-veroorzaakte schade aan het epitheel van de vleugel een snelle aanwerving van hemocytes tot en met de schade site23. Deze popstadium biedt echter enkele duidelijke voordelen voor de beeldvorming over eerder embryonale stadia. Gewonde poppen kunnen worden beeld over veel langere perioden (voor ten minste 5 h), meer weefsel gebied is beschikbaar voor de experimentele perturbation (zoals generatie van meerdere wonden) en er zijn aanzienlijk grotere aantallen aanwezig zijn op deze fase (hemocytes voorziet meer cel trajecten van verdere afstanden verbeterde statistische macht tijdens de wiskundige analyse). Bovendien, de doeltreffendheid van de inactivatie van RNAi-gemedieerde gen is aanzienlijk verbeterd in pop fasen, waardoor vele genen te worden ‘geslagen-down’ in een weefsel of de tijd-specifieke wijze in vergelijking met de meer traditionele benadering van de hele mutant van embryo’s.

Om de dynamiek van de wond opnieuw epithelialization en de begeleidende inflammatoire respons binnen dit nieuwe pop model te volgen, moeten twee verschillende cel populaties worden weergegeven: de pop epitheel en het aangeboren immuun cellen (Drosophila hemocytes). Een aantal verschillende markeringen (Tabel of Materials) beschikbaar zijn voor deze twee verschillende cel populaties label – de keuze van de markeerdraad hangt af van het specifieke proces worden bestudeerd. Ter gelegenheid van de pop epitheel, Drosophila lijnen die een bevat worden een overal uitgedrukt GFP-gelabeld E-cadherine (die etiketten adherens kruispunten) routinematig gebruikt om aan te geven van de standpunten van de marges van de cellen, of u kunt ook een GFP-gelabeld Actin-bindend domein van Moesin (die etiketten het cytoskelet actine) te visualiseren van de wond-rand contractiele actine ring en leading-edge uitsteeksels. Op het etiket van de Drosophila hemocytes, een hemocyte-specifieke srp-Gal425 tot station uitdrukking van nucleaire RFP (voor nucleaire tracking), cytoplasmatische GFP of GFP-gelabeld Moesin (naar het cytoplasma of actine cytoskelet, respectievelijk label) of een photoconvertible fluorophore (zoals Kaede) worden gebruikt. In feite, is het vaak voordelig meerdere immuun cel markeringen in combinatie te gebruiken, om gelijktijdige analyse van de nucleaire beweging en de morfologie van de cel (Zie representatieve resultaten). Echter, aangezien dit protocol het gebruik van Drosophila poppen impliceert, alleen combinaties van genetische tellers die zijn levensvatbaar totdat mid-pop fasen kunnen worden gebruikt. Ook, embryonale dodelijke voorraden zullen niet geschikt. Dit is waarschijnlijk een probleem wanneer imaging controle (of wild-type) poppen maar is belangrijk om te overwegen wanneer genen moeten worden neergeslagen of overexpressie, voor de beoordeling van hun effect op de wond sluiting of ontsteking. In het geval van vroege letaliteit veroorzaakt door gen knockdown (of overexpressie), een Gal80ts construct kan worden gebruikt voor het opwekken van de Gal4-gedreven knockdown verderop in ontwikkeling (zie discussie).

In onze recente studies, verhuizen naar het popstadium heeft ons in staat om te verzamelen van voldoende immuun cel traject gegevens analyseren van inflammatoire gedrag met behulp van geavanceerde wiskundige modellering, waardoor op zijn beurt heeft ons afleiden van nieuwe details van de wond inflammatoire lokstof signalen23. Bijvoorbeeld, deze aanpak geopenbaard dat de wond chemoattractant verspreidt zich langzaam door de ontstoken weefsel op 200 μm2/min, een veel trager dan eerder voorgesteld kleine kandidaat-moleculen zoals ATP tarief of H2O2 worden gemeld diffuus26,27,28,29; deze kleine “schade” moleculen zijn in plaats daarvan kunnen fungeren als tolerante signalen. Bovendien, door na de langdurige werking van aangeboren immuuncellen ze lossen uit de buurt van een eerste wond en zijn blootgesteld aan een tweede (gemaakt op verschillende tijdstippen na de eerste), hebben we ontdekt een tijdelijke ‘desensitization’ periode tijdens welke immune cellen zijn blind voor latere verwondingen23. Door het benutten van de mogelijkheden op lange termijn beeldvorming van het pop model, samen met de Drosophila genetische werkwillig, kan men het gedrag van bepaalde immuun cel populaties (zoals alleen die immuuncellen gerekruteerd om de wond site) volgen in reactie op latere beledigingen, met behulp van de photoconvertible fluorophore30 die uitsluitend binnen de immuun cel lineage23kan worden uitgedrukt.

Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren van de dynamiek van de reparatie van de wond en de geassocieerde inflammatoire respons op hoge spatio-temporele resolutie met behulp van levende Drosophila poppen. Wij bieden een gedetailleerde methodologie ter dekking van de stappen die nodig zijn voor de voorbereiding van de eerste poppen (dissectie en montage) en de daaropvolgende laser-gemedieerde verwonden en de time-lapse beeldvorming. Ook beschrijven we het gebruik van foto-cabriolet fluorophores toe te staan de etikettering van bepaalde immuun cel deelverzamelingen in vivo. Op de lange termijn voorzien wij dat dit nieuwe Drosophila pop model spannende mogelijkheden voor de ontrafeling van het complexe signalering dynamiek ten grondslag liggen aan de inflammatoire reactie op weefselschade zal openstellen. Door het toepassen van meer verfijnde statistische analyses kan een functies van de reactie die anders experimenteel ontoegankelijk zijn, blijven zou terwijl de verbeterde efficiëntie van RNAi kon leent voor de toepassing van genoom-brede screening binnen ontdekken immuuncellen in vivo te identificeren van nieuwe spelers immuun cel gedrag reguleren.

Protocol

Dit protocol bestaat uit vier opeenvolgende stappen: (1) voorbereiding van Drosophila voorraden en enscenering van Drosophila poppen, (2) pop dissectie en montage, (3) pop verwonden, (4) in vivo time-lapse confocal imaging. 1. bereiding van Drosophila voorraden en de enscenering van poppen Het verkrijgen van juiste Drosophila voorraden (Zie Inleiding en Tabel van materialen). Het verzamelen van jonge gezonde volwassen vliegen van de passende genotype. Selecteer volwassene vliegt met behulp van kooldioxide gas pads te kort anesthetize de vliegen en een fijn penseel over te dragen van de juiste genotype of geslacht vliegt naar een collectie flacon. 20 Maagd vrouwen en 20 mannen toevoegen aan elke flacon met standaard vliegen voedsel media (een mengsel van maïsmeel-melasse-agar, Zie Tabel van materialen) aangevuld met gist. Voor de optimale pop generatie, tip de volwassen vliegen elke dag op nieuw voedsel in frisse flesjes, houden alle flesjes bij 25 ° C.Opmerking: Als de Gal4-UAS systeem31 wordt gebruikt om te rijden van geslacht-specifieke genexpressie, alle stappen moeten worden uitgevoerd bij 25 ° C of hoger, aangezien het systeem van de Gal4-UAS temperatuur gevoelig. 18 h vóór de geplande beeldvormende vergadering ten minste 10 nieuw gevormde witte pre poppen (figuur 1A) selecteren in de flesjes (d.w.z. 0 h na de vorming van de puparium, APF) gebruik van pincet of een fijn penseel te verjagen van de poppen van het interieur flacon oppervlak en overdracht poppen zorgvuldig naar de kant van een schone lege plastic flesje.Opmerking: Dolende 3rd instar-larven kruipen omhoog uit de voedsel-medium ondergaan verpopt; nieuw gevormde witte prepupae zijn gemakkelijk geïdentificeerd als ze everted anterior spiracles bezitten en stationair (in tegenstelling tot 3rd instar-larven zijn). De schubbenlaag transformeert in de ‘puparium’ (de pop zaak) die aanvankelijk zacht en wit17. Wees voorzichtig om te voorkomen beschadiging van de poppen, aangezien dit niet alleen tot een ongewenste schade-geïnduceerde ontstekingsreactie, maar ook tot een aanzienlijke vertraging in de ontwikkeling leiden kan. Leeftijd van de geselecteerde poppen naar de juiste ontwikkelings fase (18 h APF optimale resultaten geeft) in het flesje bij 25 ° C.Opmerking: Als de poppen te ontwikkelen, de pop geval wordt geleidelijk donkerder en meer breekbaar. Andere reagentia voor te bereiden voor de volgende stap tevoren. Om de heptaan lijm, combineren een 20 cm lengte van opgerolde dubbelzijdige tape met 20 mL heptaan in een tube van 50 mL centrifuge, zegel met de paraffine film en rock op de kamertemperatuur ‘s nachts op de Bank. 2. voorbereiding en dissectie van Drosophila poppen De gefaseerde Drosophila poppen overbrengen in een stuk dubbelzijdige plakband gemonteerd op een glasplaatje. Plaats de poppen zodat de ventrale zijde stevig op de tape vast zit en de dorsale zijde naar boven zijn gericht (figuur 1B).Opmerking: De anterior van de verpopping zullen herkenbaar uit de twee spiracles uitsteken van het anterieure einde van de pop zaak. Verwijder voorzichtig poppen van hun beschermende puparium behuizing dissectie helderveld Microscoop met pincet en micro-schaar (figuur 1B-D). Aanvankelijk, maak een incisie in de regio anterior-de meeste van de puparium met behulp van de verlostang (figuur 1B). Zorg ervoor dat de pop geval ter zake holle en verstoken van pop weefsel omdat de poppen binnen het geval tijdens de vroege ontwikkeling van de pop gekrompen zal. Na deze eerste insnijding zorgvuldig scheurt of het pop geval opengesneden in een anterior posterieure richting totdat de verpopping volledig vrij van de bruin ondoorzichtige broos behuizing (Figuur 1 d is) met behulp van de verlostang of microscissors (Figuur 1 c).Opmerking: Poppen in dit stadium zijn erg kwetsbaar en moet worden gezorgd om te voorkomen dat het prikken van het pop oppervlak; prikken is duidelijk, zoals Hemolymfe snel uit de punctie-site lekt. Poppen met lekke banden, hoe klein ook, moeten worden weggegooid. Monteer de poppen in een glassbottom schotel met behulp van heptaan lijm. Gebruik een tip van 20 mL pipet om een daling van 10 mL vooraf bereid heptaan lijm (zie punt 1.6 hierboven) in een lijn op de schotel glassbottom. Laat de lijm drogen voor 5 s vóór de overbrenging van de ontleed poppen zorgvuldig op de heptaan lijm met pincet (figuur 1E). Voor het gemak van verwonding en beeldvorming, line-up de poppen op een rij; ongeveer 5 poppen worden voorgesteld, maar meer beheersbaar met ervaring zal zijn.Opmerking: Gebruik van heptaan lijm wordt aanbevolen bij het gebruik van rechtop beeldvormingssystemen maar is niet nodig bij gebruik van een omgekeerde systeem. Als de lijm wordt gemaakt met optische zal aberraties tijdens imaging, poppen direct op het dekglaasje in plaats daarvan kunnen worden geplaatst-de natuurlijke hechting tussen de pop weefsel en glas in de meeste gevallen voldoende voor stabiele imaging, zolang zorg is genomen bij het verplaatsen van de beeldvorming schotel tussen microscopen. Voor de beste resultaten, de poppen zo monteren dat de vleugel plat op het dekglaasje met de meerderheid van het oppervlak van de vleugel in direct contact met het dekglaasje (figuur 1F is). Rol de poppen met behulp van de verlostang om hun positie om ervoor te zorgen dat de vleugel is correct gemonteerd te wijzigen. Toevoegen om te voorkomen dat monster uitdroging in de beeldvorming periode, een stuk absorberend filtreerpapier gedrenkt in gedestilleerd water aan de kant van de glassbottom schotel aan het einde van montage, voorzichtig niet te verstoren, de poppen (1E cijfer). Dekking van de schotel met een deksel.Opmerking: Poppen zijn nu klaar voor om te verwonden en beeldvorming. 3. laser-geïnduceerde verwonden van Drosophila pop vleugels Overdracht van de glassbottom schotel met de gekoppelde poppen aan een breed-gebied Microscoop voorzien van een afstembare laser ablatie systeem. Gebruik een pulsed-UV luchtgekoelde stikstof-gepompt ablatie laser afgestemd op 435 nm – Zie Tabel van materialen voor details11; de exacte golflengte van het licht gebruikt voor belichting is geselecteerd door de gebruiker via een passende kleurstof-cel. Met behulp van helderveld optica, afstellen de Microscoop stadium vinden de pop vleugel van de eerste Verpopping worden (figuur 1F) gewond. Voor een optimaal resultaat de objectief van een olie-immersie 40 X of 63 X gebruiken voor zowel de beeldvorming en laser ablatie; Zorg ervoor dat de immersie vloeistof gebruikt (olie of glycerol) consistente tussen ablatie en beeldvormende systemen. De Microscoop te concentreren op het vlak van het epitheel van de pop vleugel dichtst bij het glas dekglaasje aan (dat wil zeggen de focus op de regio van het epithelium te worden verwond) aanpassen met behulp van de bedieningsknop voor fijne focus. Met behulp van de Microscoop fase aanpassingen, plaats de pop vleugel zodat het gebied te worden verwond rechtstreeks wordt uitgelijnd met het bekende doelgebied van de laser ablatie. Gebruik een energiedichtheid verzwakker dia voorzien de Microscoop handmatig aanpassen het energieniveau van het licht van het baarmoederslijmvlies.Opmerking: De schuifregelaar verzwakker heeft Klik stopt en uitspraken te identificeren van het relatieve niveau van demping en het gebruik van reproduceerbare instellingen toestaan. Met behulp van een externe handmatig trigger controle, activeren de ablatie laser met behulp van een korte muisklik voor de trigger te maken van een wond. Controleren voor het uiterlijk van de voorbijgaande luchtbel op de site van ablatie aangezien verwonding zal normaliter gepaard gaan. Controleer als de laser-geïnduceerde verwonden succesvol met behulp van de juiste TL filters geweest te visualiseren de pop epitheel.Opmerking: zorg om te voorkomen dat accidentele blootstelling aan de laserstralen zoals de weerspiegeling van de lichtbundel kunnen leiden ernstige oog tot of beschadiging van de huid. Als verwonden mislukt, variëren van het brandvlak (verplaatsen van de focus van de Microscoop iets boven of onder het huidige focal niveau) en herhaal de muisklik voor de ablatie trigger. Als alternatief, verhoog geleidelijk het vermogen van de laser met behulp van de verzwakker dia totdat de wond van de gewenste grootte is bereikt. Als u wilt variëren de ablatie laser polsslag herhaling, gebruiken de herhaling tarief -knop op de achterzijde bedieningspaneel (welke wijzigingen het tarief van minder dan 1 puls/s tot 60 Hz). Instellen voor optimale verwonden, de herhaling van de polsslag tot 40 Hz. Gebruik voor het genereren van verschillende grootte wonden, de energiedichtheid verzwakker dia handmatig aanpassen het energieniveau van de ablatie licht. Onthouden van verwonding aller de gemonteerde poppen en gebruik van deze poppen niet-ablated worden als gewonde besturingselementen. Voor consistente resultaten, moet u regelmatig het NovaSure-systeem (met behulp van de desbetreffende bedieningshandleiding) uitlijnen. Ook, reinigen en vullen van de kleurstof resonator cel waarmee de golflengte van de laser-uitgang. 4. in Vivo Time-lapse Confocal Imaging Snel de glassbottom schotel naar een passende Microscoop voor time-lapse afbeeldingen overbrengen.Opmerking: Voor optimale resultaten, gebruik een hoge specificatie confocal of draaiende schijf Microscoop uitgerust met gevoelige detectoren die zowel de mCherry als de GFP fluorophores kunnen detecteren. Gebruiken om het beeld van de hele pop vleugel, een lage vergroting (b.v. 20 X) objectief (figuur 2A). Gebruiken om de afbeelding wond reparatie en de begeleidende ontstekingsreactie met hoge ruimtelijke resolutie, de olie-immersie 40 X (NA 1.3) of 63 X (NB 1.4) objectieven (Zie representatieve afbeeldingen in figuur 2B-D). Open de juiste beeld capture software die is gekoppeld aan de Microscoop. De juiste lasers bv de 488 nm en 561 nm lasers visualiseren GFP en mCherry fluorophores, respectievelijk (door te klikken in de relevante vakken) en aanpassen van de kracht van de laser en winst/offset instellingen te geven met behulp van de image capture software, inschakelen voldoende fluorescent signaal terwijl het vermijden van pixel verzadiging; Gebruik de laagste mogelijke laser vermogen (in het bereik van 5-20%) om photobleaching en fototoxiciteit te minimaliseren. Te vangen beide de herstellen epitheel en inflammatoire cellen de rekrutering, stellen de Microscoop om vast te leggen van een z-stapel met behulp van de fijne focus aanpassing knoppen op het bedieningspaneel; voor een optimaal resultaat ingesteld de software (met behulp van handmatig knop-klikken) op record z-segmenten door de pop vleugel (minimaal elke 3 mm), vanaf de bovenkant van de gewonde epitheel door aan de extracellulaire ruimte onder (bevat migreren hemocytes) om een grote z-stack (in het bereik van 50-100 mm). Registreren voor time-lapse imaging, z-stacks op regelmatige tijdstippen (minimale elke 30 s) voor ten minste 1 h na verwonding.Opmerking: De exacte tijdsinterval tussen z-stacks gekozen vertegenwoordigt een trade-off tussen het vastleggen van de snel veranderende dynamiek van de cel en het vermijden van foto-bleken van de monsters. Naar image gelijktijdig meerdere poppen (met inbegrip van niet-ablated worden gewonde besturingselementen), door een gemotoriseerde stadium (verbonden aan de Microscoop) en de multi-positie verwerven functie beschikbaar binnen de denkbaar software te gebruiken. De positie van elke individuele Verpopping binnen de software met behulp van de fase positie controle knoppen handmatig instellen en vervolgens handmatig stel dan de juiste z-stack (boven en onder) voor elke individuele Verpopping. Visualiseer de time-lapse beelden tijdens Fotolader of later met software van de analyse van de afbeelding van de specialist (zoals ImageJ32) met behulp van z-stack projecties of 3D-weergave. Om bijvoorbeeld te volgen van de bewegingen van afzonderlijke hemocytes (zoals in figuur 2C’ en D’), track hemocyte kernen met behulp van de open-access ImageJ plug-ins “TrackMate” of “Manual Tracking” (methoden gepubliceerd in 33, 34). Gebruik photoconvertible sondes (zoals Kaede30) om selectief photoconvert en label van een subset van epitheliale of immuun cellen tijdens imaging. Openen van passende modules binnen de denkbaar software voor het uitvoeren van de photoconversion (zoals de FRAP, fluorescentie herstel na foto-bleken module) en activeren de 405nm laser (door te klikken in het vak relevante software)35. Selecteer cellen als photoconverted binnen de FRAP-software met behulp van het gereedschap vierkante, ronde of freehand selecteren. Binnen de FRAP-software, stelt de tijd-cursus voor photoconversion (Bleaching) naar een enkele iteratie/frame en de 405 nm laser op 20% laser kracht. Handmatig Klik op Start het experiment wilt uitvoeren van photoconversion. De FRAP module (Klik op sluiten) afsluiten en teruggaan naar de oorspronkelijke imaging scherm binnen de software; Gebruik de 488 nm en 561 nm lasers om het imago van het gedrag van photoconverted en niet-photoconverted cellen door het opzetten van een z-stack en time-lapse opname als hierboven.Opmerking: Photoconverted sondes stabiel blijven voor vele uren na de aanvankelijke photoconversion, waardoor het gedrag van de photoconverted cellen die moeten worden gevolgd na verloop van tijd (voor ten minste 5 h). Bijvoorbeeld, kunnen ontstekingscellen in de wond selectief photoconverted (figuur 2F) en hun gedrag gevolgd, zoals het omzetten van de site van de schade (Figuur 2 g en H).

Representative Results

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van Drosophila poppen voor live time-lapse beeldvorming van wond reparatie en ontsteking in vivo. Met deze methode moet het mogelijk zijn voor het genereren van meerdere high-resolution films van pop wond sluiting en inflammatoire cel aanwerving met gemak en om het imago van de poppen voor lange perioden (ten minste 5 h) na verwonding zonder significante photobleaching. Een algemene regeling voor de Drosophila Verpopping voorbereiding Figuur 1 illustreert de optimale methode voor het opstellen van Drosophila poppen voor in vivo imaging. Drosophila witte ‘prepupae’ zijn verzameld op ‘0 h’ na puparium formatie (APF), zoals de kruipende larven beweeglijkheid ophouden en de stereotiepe pop vorm met nemen everted ademhaling aanhangsels (spiracles) zichtbaar aan het einde van hun voorste-meeste ( Figuur 1A). De witte 0 h APF prepupae zijn toegestaan om te ontwikkelen voor 18u bij 25 ° C, tegen die tijd de puparium geworden brown (figuur 1B) en zijn vervolgens ontleed met fijne pincet en/of microscissors (Figuur 1 c, voor het verwijderen van de pop beschermhoes) te onthullen de optisch doorschijnend Verpopping binnen (Figuur 1 d). Na dissectie zullen de pop vleugels zichtbaar aan de laterale zijden van de pop thorax (aangegeven in blauw, Figuur 1 c-D). In dit stadium zijn andere pop lichaamsdelen ook gemakkelijk te onderscheiden, met inbegrip van de ogen, benen en buik (aangeduid in Figuur 1 d). De poten zijn ook geschikt voor wond ontsteking studies en kunnen worden verwond met behulp van dezelfde laser methode zoals hierboven beschreven. Meerdere 18 h APF poppen kunnen gemonteerd worden gelijktijdig binnen de imaging schotel (het1E cijfer, gebruik heptaan lijm en een filtreerpapier water doordrenkte om te minimaliseren van uitdroging) platste gedeelte van vleugel (overzicht blauw) in contact met het dekglaasje aan ( Figuur 1F); Dit is vooral gunstig als de imaging Microscoop is uitgerust met een gemotoriseerde stadium om verschillende poppen worden geregistreerd in één enkele imaging periode. Alle poppen die schade hebben opgelopen tijdens de dissectie of montage moeten worden weggegooid (bijvoorbeeld de verpopping gevestigd derde in de reeks, pijl in figuur 1E). Andere lichaamsdelen (bijvoorbeeld ogen en benen, overzicht roze) kunnen ook contact opnemen met het dekglaasje aan en zijn beschikbaar voor het verwonden en latere imaging (Figuur 1F). Voor experimenten bestuderen van enkele wonden, worden laser-veroorzaakte schade over het algemeen best toegebracht centraal in de vleugel (sterretje, figuur 1F), hoewel andere locaties kunnen worden gebruikt als meerdere wonden worden bestudeerd. Steriele verwonden activeert een robuuste inflammatoire respons in de Drosophila pop vleugel Om te kunnen volgen van reparatie van de wond en de begeleidende inflammatoire respons in vivo, de gewonde vleugels van 18 h APF Drosophila poppen werden beeld met behulp van de confocal time-lapse microscopie (figuur 2A-H). Op deze popstadium zijn het epitheel van de vleugel eenvoudige vlakke bladen van cellen (label hier met behulp van E-cadherine GFP-gelabeld ter gelegenheid van individuele celbegrenzing marge wing geschetst in figuur 2A). Zelfs in de gewonde vleugels (lage vergroting, figuren 2A en 2A’), grote aantallen trekkende aangeboren immuun cellen (hemocytes, aangeduid met behulp van de srp-Gal4 gedreven cytoplasmatische GFP, groen, en nucleaire RFP, magenta) zijn te vinden in de (Hemolymfe insect bloed) bezetten de tussenliggende extracellulaire ruimte (figuur 2A en 2A’). Laser-veroorzaakte schade aan het epitheel van de pop vleugel (wond marge geschetst in figuur 2B-D-wit) stimuleert een snelle migratie van hemocytes naar de site van de wond (figuur 2B-D en immuun celkernen in figuur 2B ‘-D’). Labelen van de hemocytes met zowel een nucleaire marker (bijvoorbeeld de nucleaire RFP “rood-stinger”) in combinatie met een cytoplasmatische of cytoskeletal marker (bijvoorbeeld cytoplasmatische GFP of GFP-gelabeld Moesin) is bijzonder voordelige aangezien het toestaat de gelijktijdige opvolging van hemocyte kernen (voor geautomatiseerde analyse van hemocyte gedrag bijvoorbeeld migratie snelheid en gerichtheid) en de visualisatie van hemocyte morfologie. Dit laatste is belangrijk omdat het ons toelaat om te bepalen of hemocytes necrotisch vuil zijn phagocytosing (figuur 2C, inset) op de rand van de wond (of microben in het geval van infectie)12,23 en maakt het ook mogelijk ons te volgen hun protrusive gedrag als ze fijn filopodia of lamellipodia op hun toonaangevende uitbreiden als ze naar of uit de buurt van de wond migreren. Eenvoudig bijhouden hemocyte nucleaire gevaar opleverende met behulp van passende beeldanalyse software32 (Tabel of Materials) demonstreert de complexe spatio-temporele dynamiek van de ontstekingsreactie, vergelijkbaar met die eerder gerapporteerd voor gewond embryo’s9,36 (multi-gekleurde tracks, figuur 2C’ en D’). Binnen slechts 30 minuten van verwonding, beginnen hemocytes dichtst gelegen aan de schade-site gestuurde migratie naar de wond (figuur 2C’). Echter, met de toenemende tijd na letsel, hemocytes gelegen geleidelijk verder uit de buurt van de site schade ook beginnen gestuurde migratie naar de wond (figuur 2D’). Op deze manier wordt een ‘wave’ van immuun cel ontvankelijkheid die zich naar buiten vanaf de rand van de wond verspreidt waargenomen, die wij voorzien aan de verspreiding van de wond chemoattractant vanaf de plaats van de schade. Deze dynamiek spatio-temporele immuun cel verstrekt een nuttig uitgangspunt voor onze recente studie, die in dienst van geavanceerde wiskundige modellering (‘Bayesian gevolgtrekking’) analyse afleiden van nieuwe eigenschappen van de wond lokstof signaal (gedetailleerde methoden gepubliceerd in23). Door het kalibreren onze rekenmodellen (die de wond lokstof verloop gekoppeld aan hemocyte bias) aanpassen aan de waargenomen in vivo immuun trajecten, kon een gedetailleerde kenmerken van de wond lokstof uittreksel uit onze hemocyte traject gegevens (zoals het signaal diffusie tarief, de bron en de duur van signaal productie)23. Bovendien, door het rijden van expressie van het photoconvertible fluorophore Kaede binnen de bloedlijn van de immuun cel met behulp van de srp-Gal4 (groen, 2E figuur) ook hebben wij kunnen selectief label (zoals een subpopulatie van deze migratiestromen vleugel hemocytes die aangeworven op de site van de wond; E, voor UV-geïnduceerde photoconversion en F, post-photoconversion). We kunnen dan het gedrag van deze hemocytes na verloop van tijd (magenta, Figuur 2 g-H) volgen als ze uit de buurt van de wond site (pijlen, Figuur 2 g en H) lossen en vergelijkt hoe hun gedrag verschilt van die niet-photoconverted cellen die de schade-site niet te bereiken. We hebben deze in vivo labeling techniek gebruikt om aan te tonen dat hemocytes aangeworven voor een initiële wond tijdelijk ongevoelig zijn voor een tweede wond gegenereerd 90 minuten later23, hoewel deze differentiële labeling techniek kan ook vele andere inzichtelijke toepassingen in de toekomst hebben (zie discussie). Met behulp van deze aanpak, we kunnen ook gelijktijdig volgen de spatio-temporele dynamiek van wond reparatie of bent-epithelialisation’ (figuur 2B-D). Hier overal uitgedrukt GFP-gelabeld E-cadherine etiketten de kruispunten van de cellulaire adherens in heel de vleugel epitheel en maakt de vormen van afzonderlijke epitheliale cellen moeten worden gevolgd na verloop van tijd. De rand van de wond is gemakkelijk geïdentificeerd als het kruispunt tussen intact GFP-geëtiketteerden epitheliale cellen en labelloze puin (witte onderbroken lijn, figuur 2B-D). Voor de meerderheid van wonden begint de wond te opnieuw epithelialize binnen 1 uur van het letsel en de wond rand voorschotten naar binnen (figuur 2D); wonden van deze omvang zullen meestal genezen binnen 2-3 uur van letsel23. Sluiting van de wond in zowel de embryo’s en de poppen wordt gedreven door een kabel actomyosine contractiele samen met toonaangevende actine-rijke filopodia23,37; Deze cytoskeletal dynamiek kan rechtstreeks worden gevisualiseerd tijdens reparatie van de wond met behulp van passende in vivo verslaggevers, zoals GFP-gelabeld Spaghetti squash (Myosin lichte reguleringsketen) of GFP-gelabeld actine-bindende Moesin23. Voor sommige bijzonder grote wonden, echter de actomyosine kabel en toonaangevende filopodia blijven niet behouden – deze wonden worden ‘chronische’ en nooit helemaal opnieuw epithelialize23 zelfs na veel langere (meer dan 24 h) in vivo Imaging. Interessant is dat is de ontstekingsreactie die zijn gekoppeld aan deze niet-genezende wonden duidelijk verschillend van die geassocieerd met normale acute wonden23 suggereren dat abnormale immuun cel gedrag zou een nuttige prognostische marker in de kliniek . In de toekomst verder in vivo analyse van chronische wonden met behulp van langdurige imaging (meer dan 24 h) in het pop model misschien belangrijke mechanistische inzicht bieden in deze invaliderende aandoening. Figuur 1: Drosophila Verpopping voorbereiding verwonding en live-imaging. (A) Drosophila Witte prepupae verzameld bij 0 h APF, met anterior einde aangegeven door everted ademhaling aanhangsels (spiracles). (B) na de vergroting Wit 0 h APF prepupae voor 18u bij 25 ° C, verschijnt de puparium bruin. Dissectie van de pop zaak moet beginnen bij de voorste-meeste regio (pijl), aangegeven door de everted spiracles zoals de verpopping juiste afwezig is uit deze regio, en fijne pincet en/of microscissors gebruikt om de pop beschermhoes (C). De pop vleugels zullen zichtbaar aan de laterale zijden van de pop thorax (blauwe lijnen). (D) pop geval volledig verwijderd vanaf 18 h APF verpopping, hier de verpopping is uitgerold 90 ° om aan te tonen van de laterale zijde, met de vleugel aan het beeld worden geschetst in het blauw. (E-F) Vijf 18u APF poppen gemonteerd op glas dekglaasje aan in imaging schotel heptaan lijm, met water doordrenkte filtreerpapier om te minimaliseren van uitdroging (E). Verpopping gelegen derde in de reeks (pijl) moet worden verwijderd, terwijl de schade zich heeft voorgedaan tijdens de voorbereiding. Poppen zijn gemonteerd met het platste gedeelte van de vleugel (overzicht blauw) in contact met het dekglaasje aan (F) en laser-geïnduceerde wonden centraal worden gegenereerd in de vleugel (sterretje, F), hoewel andere locaties kunnen worden gebruikt als meerdere wonden worden bestudeerd. De afbeelding in (D) aangepast met toestemming van wevers et al., 201623. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: Dynamische in vivo analyse van de inflammatoire reactie op weefselbeschadiging. Poppen van beschermende pop gevallen ontleed en gemonteerd op glas dekglaasje aan (A) zijn gewond en vervolgens beeld met behulp van de confocal time-lapse microscopie (B-H). Lage vergroting weergave van de gewonde pop vleugel (A, vleugel marge geschetst in wit) waarin grote aantallen migrerende hemocytes (A’). Laser-veroorzaakte schade aan het epitheel van de pop vleugel (B-D, celbegrenzing aangeduid met behulp van GFP-gelabeld Drosophila E-cadherine; wond marge geschetst in wit) activeert een snelle ontstekingsreactie met de migratie van meerdere hemocytes ( SRP-Gal4 gedreven uitdrukking van nucleaire RFP, magenta en cytoplasmatische GFP, groen) naar de site van de wond (B-D; representatieve frames uit een time-lapse film waarin elk frame een projectie van 25 segmenten 3 μm is). Handmatige tracking van hemocyte trajecten (multi-gekleurde sporen, C’ en D’) geven de complexe spatio-temporele dynamiek van de ontstekingsreactie, vergelijkbaar met die voor gewonde embryo’s gerapporteerd. Hemocytes ook phagocytose necrotische cellulaire puin op de site van de wond (pijlpunt, C en ook inzet). Uitdrukking van de photoconvertible fluorophore Kaede in de immuun cel afkomst (groen, E, met behulp van de srp-Gal4) in staat stelt wond-aangeworven hemocytes (pijl, E) differentieel worden aangeduid (magenta, F) en gevolgd na verloop van tijd als het omzetten van de site schade (pijlen, G en H). De volgende pop genotypen werden gebruikt: (A-D) w1118; ubi-DE-cad-GFP, srp-Gal4 > UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) en (E-H) w1118; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Afbeeldingen aangepast met toestemming van wevers et al., 201623. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De acute inflammatoire reactie op weefselbeschadiging is een complex en zeer dynamisch proces, dat is essentieel om te orkestreren van de reparatie van de gewonde weefsel, met inbegrip van de goedkeuring van de necrotisch puin en de strijd tegen infecties. Om volledig te begrijpen en ontrafelen van de fundamentele aspecten van deze reactie, is het van cruciaal belang dat studies uitgevoerd in vivo op 3-dimensionale levende voorbeelden om de precieze gedrag zijn en interacties tussen de verschillende cel lineages betrokken moet worden gevolgd nauwkeurig na verloop van tijd. Real-time analyse van de dynamiek van deze cel kunt een meer gedetailleerde karakterisering van mutant fenotypen dan statische enkele tijd-punten van vaste monsters met behulp van klassieke immunohistochemistry technieken. Traditioneel, hebt meeste live-imaging studies met behulp van het genetisch hanteerbare Drosophila model de embryonale fase van fruitfly ontwikkeling vanwege de optische translucentie en immobiliteit ten opzichte van de latere ontwikkelingsstadia4 gebruikt , 5. echter meer recentelijk onze fractie en anderen hebben ontwikkeld de verpopping Drosophila als een nieuw model voor het uitvoeren van hoge resolutie en op lange termijn beeldvorming van de reparatie van de wond en ontsteking gelijktijdig in vivo8,22 ,23. Deze nieuwe benadering biedt een opwindend op lange termijn potentieel voor ontrafeling fundamentele aspecten van het gedrag van de inflammatoire cel en kan verder worden aangepast om te onderzoeken het dynamisch gedrag van andere geslachten van de cel (zoals Drosophila adipocytes 38) weefsel schade na.

Er zijn een aantal kritische factoren bij de voorbereiding en de beeldvorming van gewonde Drosophila poppen die bepalend zijn voor de kwaliteit van de beeldvorming resultaten zoals hierboven beschreven. Misschien wel is de moeilijkste stap van het beschreven protocol de zorgvuldige dissectie en nauwkeurige positionering van de poppen voorafgaand aan verwonding en beeldvorming. Poppen developmental vooralsnog zijn uiterst kwetsbaar en zelfs kleine accidentele schade aan de poppen tijdens voorbereiding stadia zal aanzienlijk afbreuk doen aan het experiment; alle poppen die onbedoelde schade kunnen hebben opgelopen moeten worden verwijderd uit het experiment, aangezien deze schade kon zijn eigen ontstekingsreactie, die kan leiden tot meer wijdverspreide (of zelfs systemische) effecten op gedrag van de inflammatoire cel elders in activeren de verpopping. Als gevolg van de verdere ontwikkeling van de poppen gebruikt in deze experimenten (die ondergaan belangrijke weefsel herschikkingen ter voorbereiding van weefsels van volwassenheid), af en toe de poppen gaan in de loop van de beeldvorming. Pop rollen is, echter, meer kans op het optreden als poppen hebben niet is correct gemonteerd met het platste oppervlak van de vleugel (of ander weefsel te worden beeld) in het directe contact met het dekglaasje; gebruik van heptaan lijm te stabiliseren van de poppen op de cover glas moet minimaliseren deze ongewenste beweging. Om deze reden, moet grote ook worden gezorgd om te voorkomen dat loskomt van de poppen uit hun zorgvuldig uitgelijnd posities bij het verplaatsen van de monsters tussen microscopen; Idealiter zal de verwonding laser worden gehecht aan de dezelfde Microscoop voor latere time-lapse beeldvorming en foto-conversie moet worden gebruikt.

Naast de vaardigheid van de pop dissectie en montage stappen, zal het exacte genotype van de poppen van de Drosophila gebruikt hebben een significant effect op de kwaliteit van de beeldvorming gegevens gegenereerd. Bijvoorbeeld, zal het aantal exemplaren van de Gal4 bestuurder en UAS constructies (bv UAS-GFP of UAS-Kaede) binnen een afzonderlijke pop genotype de signal-to-noise verhouding bepalen tijdens latere imaging. Als algemene regel, de meer exemplaren van een Gal4 of UAS construeren heden, des te groter het totale niveau van fluorescente proteïne (bijvoorbeeld GFP of Kaede) binnen het weefsel. Het optimale niveau van fluorescente proteïne zal echter een zorgvuldig evenwicht tussen verheffende weefsel fluorescentie voldoende om hoge kwaliteit imaging (waardoor het gebruik van lagere laser bevoegdheden, vermindering van photobleaching en beeldvorming over langere tijd periodes) maar zonder fluorophore-geïnduceerde cellulaire toxiciteit; het optimale aantal Gal4 en UAS constructies in elk experiment zal variëren naargelang het meer bepaald de locomotiefbemanningen en fluorophores wordt gebruikt. Zorg moet worden genomen om de poppen bij 25 ° C (of boven, tot 29 ° C) verhogen omdat het Gal4-UAS-systeem temperatuur gevoelig is en ineffectief bij lagere temperaturen31zal worden. Oog op extra niveaus van controle over het weefsel of tijd-specificiteit van Gal4 –gedreven van expressie, kan de Gal4-UAS systeem onderdrukker Gal80 ook worden opgenomen in de pop genotype39. Gal80 ofwel kan worden gebruikt om te onderdrukken Gal4 activiteit binnen een bepaald weefsel (met behulp van een weefsel-specifieke Gal80) of op een bepaald moment (met behulp van een temperatuur gevoelige Gal80). Het Gal4-UAS-systeem kan verder worden gecombineerd met andere onafhankelijke binaire systemen (zoals de LexA –lexAop en QF –QUAS systemen) voor het genereren van Drosophila heeft meerdere constructies (bv fluorophores, RNAi lijnen of andere genetische constructies) gelijktijdig uitgedrukt in een aantal verschillende weefsels en39.

Gebruik van dit nieuwe Drosophila pop model biedt een aantal voordelen ten opzichte van de meer traditionele benadering van het embryo. In vergelijking met de kortlopende beeldvorming (tot 3 h) beschikbaar in fase 15 embryo’s (het stadium waarin meest embryonale verwonden studies zijn uitgevoerd), poppen kunnen worden beeld over aanzienlijk langere periode van tijd (in principe tot volwassenheid na 96 h van pop ontwikkeling ). Bovendien, veel grotere aantallen hemocytes (Drosophila ingeboren immune cellen) zijn aanwezig in pop weefsels (en beschikbaar voor imaging) in vergelijking met de meer beperkt aantal aanwezig in het embryo en dit heeft ons toegestaan om te verzamelen aanzienlijk meer Imaging gegevens over hemocyte gedrag met behulp van de dezelfde totale aantal specimens. Cruciaal, dit, op zijn beurt, heeft ons in staat om toe te passen meer geavanceerde wiskundige modellering te analyseren hemocytes gedrag en uitpakken van de nieuwe functies van de wond lokstoffen en inflammatoire respons die experimenteel anders zou gebleven ontoegankelijke23. Een ander voordeel van de pop model is dat gene RNAi-gemedieerde knockdown is aanzienlijk efficiënter dan in eerder embryonale stadia, waardoor verbeterde analyse van weefsel of inactivering van de tijd-specifieke gen met behulp van binaire systemen zoals het Gal4-UAS-systeem 39. de efficiëntie van RNAi in dit stadium dus ontsluit het potentieel voor het uitvoeren van grootschalige (of zelfs onbevooroordeelde genoom-brede) RNAi schermen om te zoeken naar nieuwe spelers die betrokken zijn bij de reparatie van de wond of inflammatoire cel gedrag.

Nochtans, Drosophila poppen duidelijk niet worden gebruikt om te studeren de fenotypen als gevolg van genetische mutaties die embryonale dodelijke; functionele en live-imaging studies van genen die essentieel voor de ontwikkeling van het embryo zijn moeten dus nog in embryo’s worden uitgevoerd, tenzij RNAi-gemedieerde gene knockdown in een tijd of weefsel-specifieke wijze ontwikkeling toelaat plaatsvinden via pop stadia. Het embryo blijft ook het model van de keuze om te studeren en wonen-image bepaalde functies van immuun cel gedrag, met inbegrip van de ontwikkelingstoxiciteit versnippering van immuuncellen van hun oorsprong, contact-inhibitie van voortbewegen en fagocytose van apoptotic lijken gegenereerd tijdens developmental weefsel beeldhouwen5,8 , die nog niet zijn nagekomen in pop modellen. Hoewel studies in Drosophila larven en volwassenen hebben verstrekt een belangrijk inzicht verschaffen in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de wond reparatie en ontsteking40,41,42,43, 44 live-imaging studies in deze stadia hebben bewezen moeilijk vanwege de inherent mobiele aard van de monsters. Terwijl larven kunnen worden verdoofd dat korte perioden voor live-imaging, wegens het tijdelijke karakter van de narcose, alleen korte momentopnamen van de levende wond herstellen of inflammatoire respons kunnen gevisualiseerde45. Een recente studie heeft nu een verbeterde protocol waarmee langerlopende beeldvorming van larvale wond genezing46, hoewel voorbereiding en imaging nog aanzienlijk meer uitdagend blijven dan in embryo’s of poppen ontwikkeld. Op de lange termijn voorzien wij dat door gebruik te maken van de meest geschikte ontwikkelingsstadium aan elke specifieke vraag, studies in alle vier van deze verschillende fasen van de Drosophila – van embryo’s door larven en pop perioden naar volwassenheid (elk met hun eigen unieke voordelen en beperkingen) – krijgt aanvullende inzichten in het mechanisme van het moleculaire en cellulaire reparatie van de wond en ontsteking te rijden.

In de toekomst dit protocol voor verwonden en op lange termijn beeldvorming van Drosophila poppen kan gemakkelijk aangepast worden aan een waaier van ontsteking-gerelateerde fenomenen te bestuderen en heeft verstrekkende potentieel blootleggen roman kenmerken van de wond van de inflammatoire reactie. De combinatie van langdurige imaging, samen met de toepassing van photoconvertible fluorophores (zoals Kaede), zijn van grote waarde voor het inzicht in de dynamiek van het aangeboren immuun cel gedrag en in het bijzonder de verre minder begrepen resolutie fase van de wond inflammatoire respons. Door labeling specifiek individu of subpopulaties van immune cellen (zoals die aangeworven op een wond) het mogelijk is om te analyseren hoe de blootstelling aan een milieu cue (zoals een lijk of letsel) beïnvloedt de immuun cel latere reactie op een later Cue. De inflammatoire werking van Drosophila hemocytes kan worden gewijzigd door eerdere ervaringen – bijvoorbeeld, zij zijn gereed gemaakt om te reageren op weefsel schade door voorafgaande fagocytose van apoptotic lijken tijdens ontwikkeling12 maar het valt nog te bezien andere milieu signalen veroorzaken of soortgelijke priming evenementen. Hoewel studies van pop wonden tot nu toe hebben gericht op de aangeboren ontstekingsreactie, de pop vleugel model ook biedt een ideale gelegenheid om zowel live-image en ontleden de mechanismen die ten grondslag liggen aan de epitheliale wond reparatie. Bovendien, deze pop beeldvorming methode kan ook worden aangepast om te onderzoeken het dynamisch gedrag van andere geslachten van de cel in reactie op weefsel schade38, hetzij in de pop vleugel zelf of andere gemakkelijk toegankelijke pop weefsels (zoals de ogen, benen of borstkas). Tot slot, door het combineren van de genetische werkwillig van Drosophila samen met het gemak van langdurige pop beeldvorming, nieuwe epitheliale reparatie of inflammatoire regelgevers zou ontdekt door de toepassing van onbevooroordeelde genoom-brede knock-down benaderingen.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zouden graag bedanken leden van Martin, Nobes, Richardson en hout labs voor nuttige discussie. Wij danken ook de Wolfson Bioimaging faciliteit (Universiteit van Bristol, UK), Bloomington voorraad centrum (Universiteit van Indiana, USA) en Vienna Drosophila Resource Centre (voor Drosophila voorraden) en Flybase (voor up-to-date Drosophila gen aantekening). Dit werk werd ondersteund door een projectsubsidie MRC tot uur en W.W. (heer/J002577/1), een Wellcome Trust Senior Fellowship aan W.W. en een Wellcome Trust Investigator Award tot uur.

Materials

Drosophila stocks
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin
;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)		 Kyoto Stock Center, DGRC #109007 Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin
;;Ubi-p63E-shg.GFP (III)		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #58742 Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged Moesin
P{sGMCA}3.1		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #59023 The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T.
hemocyte specific serpent-Gal4 driver
;srp-Gal4;		 Generated by Katja Bruckner Generated by Katja Bruckner Expression of ScerGAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP
w1118;;P{UAS-RedStinger}6		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #8545 or #8547 UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal
UAS-cytoplasmicGFP
;;P{UAS-GFP.S65T}		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) Multiple stocks available (e.g. #1522) Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness.
UAS-photoconvertibleKaede
w1118;; P{UAS-Kaede.A}3		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #26161 Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV.
GFP-tagged spaghetti squash
w1118;;P{sqh-GFP.RLC}		 Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) #57145 The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:AvicGFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter.
Name Company Catalog Number Comments
Ingredients for fly food media Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)
maize Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
soya flour Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
malt extract Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
molasses Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) Contact supplier direct organic
Difco agar BD Biosciences, Fisher Scientific DF0142-15-2 For preparation of fly food
Propionic acid Sigma 402907 For preparation of fly food
Nipagen Sigma 79721 For preparation of fly food
Dried baker's yeast Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD For preparation of fly food
Name Company Catalog Number Comments
Sample preparation and mounting
Parafilm Sigma P7793-1EA For preparation of heptane glue
Fine sable paintbrush Daler-Rowney (or equivalent) #0 or 1
Forceps Fisher Scientific (or Fine Science Tools) NC9404145 Dumont #5
Glass bottomed dishes for imaging MatTek P35G-0-10-C We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment.
Heptane Sigma 51730-5ML For preparation of heptane glue
Double sided sticky tape (e.g. Scotch) Agar Scientific AGG263 For preparation of heptane glue
50ml tube (for heptane glue) Falcon tubes from Fisher Scientific 14-432-22 For preparation of heptane glue
Glass microscope slides Agar Scientific AGL4244 For dissection of Drosophila pupae
Dissecting stereo microscope with brightfield Leica (or equivalent) M50 For dissection of Drosophila pupae
Microscissors John Weiss International 103123 Miniature Research Scissors (straight)
Name Company Catalog Number Comments
Laser ablation and imaging
Nitogen ablation laser Spectra-Physics (or Andor equivalent) Model VSL-337ND-S For wounding, this should be attached to a widefield imaging system
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) Leica (or equivalent) TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal)
Environmental chamber Life Imaging Services (or equivalent) "Microscope Temperature Control System" Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging
Name Company Catalog Number Comments
Image Analysis Software
FRAP software module Leica (or equivalent) CLSM FRAP software module For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede
ImageJ (image analysis software) National Institutes of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/ Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012.
ImageJ plugin "Manual Tracking" National Institutes of Health (NIH) https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ plugin "TrackMate" ImageJ, NIH https://imagej.net/TrackMate Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (high performance 3D imaging software) Perkin Elmer Volocity 6.3 For image analysis
IMARIS (image analysis software) Bitplane IMARIS for Cell Biologists For image analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration. Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).
  2. Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
  3. Martin, P., Nunan, R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing. British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).
  4. Razzell, W., Wood, W., Martin, P. Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila. Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).
  5. Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
  6. Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).
  7. Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model. Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).
  8. Weavers, H., Wood, W. Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior. Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).
  9. Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).
  10. Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).
  11. Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release. Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).
  12. Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response. Cell. , (2016).
  13. Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos. EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).
  14. Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing. Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).
  15. Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo. Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).
  16. Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis. Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).
  17. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  18. Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).
  19. Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).
  20. Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
  21. Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae. Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).
  22. Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. Drosophila pupal macrophages–a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution. European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).
  23. Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).
  24. Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development. Development. 117 (2), (1993).
  25. Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
  26. Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. . Physik fur Biologen. , (1991).
  27. Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. Biofilms II Process Analysis and Application. , 373-405 (2000).
  28. . Cell Biology by the Numbers Available from: https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1 (2015)
  29. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  30. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  33. Grueber, W., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  34. Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).
  35. Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
  36. Franz, A., Wood, W., Martin, P. Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection. Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).
  37. del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).
  38. Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
  39. Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).
  40. Galko, M. J., et al. Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae. PLoS Biology. 2 (8), e239 (2004).
  41. Brock, A. R., et al. Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae. Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).
  42. Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).
  43. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation. Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).
  44. Kakanj, P., et al. Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing. Nature Communications. 7, 12972 (2016).

Tags

In Vivo TrackingInflammatory Cell DynamicsDrosophila PupaeLive ImagingWound HealingInnate ImmunityRNAiGene InactivationPupal StageHemocytePupae CollectionPupal CasingDissectionMountingHeptane Glue

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Weavers, H., Franz, A., Wood, W., Martin, P. Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (136), e57871, doi:10.3791/57871 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image