生体内で高分子量カットオフと間質液を脳から大規模な細胞外タンパク質を収集するマイクロダイアリシス法プローブします。
Summary
In vivoマイクロダイアリシスが分子目を覚まし、自由行動下動物から脳間質液 (ISF) の現在のコレクションを有効にします。Isf 形式で比較的大きな分子を解析するために現在の記事は特にプローブを用いた膜切断高分子量マイクロダイアリシス プロトコルで説明します。
Abstract
In vivoマイクロダイアリシスは、透析の原理に基づく目を覚まし、自由行動下の動物から ISF を収集するために強力な手法です。最近も ISF プローブを用いた切断高分子量の大きい分子のダイナミクスを評価するために使用されていますマイクロダイアリシスは比較的低分子のアミノ酸や神経伝達物質などを測定する確立された方法が、膜。このようなプローブを使用すると、時にマイクロダイアリシス圧力プローブの中に蓄積を避けるためにプッシュプル ・ モードで実行するがあります。ステップバイ ステップ プロトコル定位手術、ISF から蛋白質を収集するマイクロダイアリシス ラインを設定する方法などを説明します。マイクロダイアリシス中、薬は全身か ISF に直接注入によって管理できます。逆マイクロダイアリシス、ISF に化合物を直接注入する手法です。マイクロダイアリシス灌流バッファーの薬剤の包含 ISF を同時に収集しながらプローブは、ISF に拡散することができます。例としてタウ蛋白を測定することによって、著者は、ピクロトキシンの逆マイクロダイアリシスによる刺激的な神経活動時にそのレベルを変更する方法を示しています。マイクロダイアリシスの利点と制限は、他の方法を組み合わせて、拡張アプリケーションと共に説明します。
Introduction
ISF 全脳容積の 15-20% とシグナル伝達、物質輸送、廃棄物のクリアランス1重要な微小環境を提供しています。したがって、生きている動物から ISF の収集能力は疾病メカニズムと同様、様々 な生物学的プロセスに重要なものを提供します。In vivoマイクロダイアリシス サンプルでは、いくつかの方法の 1 つと動物を自由に移動から目を覚まし、ISF から細胞外分子を定量化し、それにより神経科学研究フィールド2,3に有用なツールとして提供しています。この方法で半透膜にマイクロダイアリシス プローブを脳に挿入、比較的低流量灌流バッファーと潅流 (0.1-5 μ L/分)。この灌、isf 形式で細胞外の分子を受動的濃度勾配に従ってプローブに拡散し、透析液を収集します。この記事はサンプル脳内 ISF メソッドに焦点を当て、原則と方法の両方適用できます他の臓器に適切な変更が必要に応じて。
脳内アミノ酸や神経伝達物質を含む小分子を収集するために広く使用されていますし、マイクロダイアリシスには 1960 年代初頭に初めて採用されました。ただし、マイクロダイアリシス プローブ高分子膜 (100 kDa 3 MDa) を断つと、最近の商業的利用だけでなく、4、5,6 は isf 形式で比較的大きい蛋白質への応用が広がった、7。これらのプローブを用いた研究は、発見につながっているそのタンパク質タウや α-シヌクレインが長いと考えられていたなど排他的な細胞質が ISF4,5,8で生理学的存在も。
マイクロダイアリシス プローブを用いた大規模な遮断膜 (通常以上 1,000 kDa) 難しさの 1 つです、限外濾過流体損失蓄積プローブの内部圧力のために影響を受けやすい。ここマイクロダイアリシス プローブは、この問題を回避するユニークな構造を持っています。この構造のため、圧力構築されません、したがってマイクロダイアリシス プローブではシリンジ ポンプを使用して (= プッシュ) プローブとプローブ コンセントから透析液の到来を収集するローラー/ペリスタルティック ポンプを灌流する「プッシュプル」モードで操作されるべきです(= プル)9 (圧力通気孔、プローブの現在のキャンセルのため、プッシュとプルの両方のポンプが必要がありますがシステムが技術的にのみによって駆動されるプル ポンプ)。この記事はガイド カニューレ注入の定位手術で始まり、1,000 kDa カットオフ膜マイクロダイアリシス プローブを介して ISF を収集するためにマイクロダイアリシス線を設定する方法について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
透析膜を切断高分子量がプッシュプル ・ モードで作動する、従ってそれは流量が正確で一定であることが重要。流量の不正確さは、空気バブル世代とサンプル濃度の矛盾の原因をすることができます。流れに整合性がない場合は、漏洩のすべての接続を確認します。問題が引き続き発生する場合は、新しいプローブとチューブを再開始する必要があります。
Microdilaysis ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業によって支えられた「新学術研究領域 (脳タンパク質老化と認知症 Control)(15H01552) 文部科学省科研費若手研究 (B) (16 K 20969) から。このメソッドの開発中に技術的なアドバイスを著者ありがとう博士デビッド ・ m ・ ホルツマンと博士ジョン ・ r ・ Cirrito
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
Referências
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