Nerede konularda kesme: Bir diseksiyon ve fare Retina mekansal oryantasyon analiz Rehber'den oküler yerler
Summary
Bu iletişim kuralı derin oküler yerler, s-opsin immünhistokimya, Retistruct ve özel kod doğru ve güvenilir bir şekilde izole fare retina anatomik uzayda yönlendirmek için kullanımı için kapsamlı bir diseksiyon ve analiz rehber sağlar.
Abstract
Boyutu degradeler Retina hücre tiplerinin ve yoğunluk analizi de dahil olmak üzere görsel neuroscience, birçok çalışma için önemli doğru ve güvenilir bir şekilde izole fare retina kayma yönünü belirleme yön yön-seçmeli olarak ayarlama ganglion hücrelerinin ve topografik dejenerasyon desenleri bazı retina hastalıkları olarak muayene. Ancak, tanımlamak ve fare retina Retina yönde etiketlemek için kullanılan literatürde bildirilen birçok farklı oküler diseksiyon yöntemleri vardır. Bu tür çalışmalarda kullanılan yönlendirme yöntemi genellikle gözardı edilir iken değil raporlama nasıl Retina yönlendirme belirlenir tutarsızlıkları edebiyat ve karışıklık çalışmalar arasında verileri karşılaştırmak çalışırken neden olabilir. Kornea yanığı gibi yüzeysel oküler simge yapılara sık kullanılan ama son zamanlarda rektus kasları, choroid çatlak veya s-opsin gradyan gibi daha derin yerler daha az güvenilir olduğu gösterilmiştir. Burada, kapsamlı bir rehber için doğru bir şekilde incelemek ve bir izole fare retina kayma yönünü belgelemek için derin oküler yerlerinden kullanımını sağlamak. Ayrıca iki s-opsin antikorların etkinliği karşılaştırıldığında ve s-opsin immünhistokimya için bir protokol dahil. Retina göre s-opsin degradenin yönünü Retistruct yazılımı ile retina yeniden yapılanma ve özel kod ile dönme gerektirdiğinden, biz hem bu programları kullanmak için gereken önemli adımlar sundu. Genel olarak, bu iletişim kuralının amacı güvenilir ve yinelenebilir bir dizi yöntem en deneysel protokoller için uyarlanabilir doğru Retina yönlendirme için teslim etmektir. Gelecekteki çalışmaları için Retina yönlendirme yöntemleri standartlaştırmak için bu eser kapsamlı bir amacı olduğunu.
Introduction
Bir önemli ve bazen gözden Retina nörolojik uygun yönlendirmeyi ve izole bütün Dağı retina analizini bir retina bir elektrofizyoloji kayıt odasında ya da histolojik slayt üzerindeki yönünü olsun yönüdür. Bu, özellikle şu anda memeli görsel sistemin araştırmalar için en çok kullanılan modeldir fare retina içeren çalışmalar için önemlidir. Fare retina dağınık şekilde üniforma değil ama melanopsin ganglion hücrelerinin, geçici OFF-Alfa ganglion hücrelerinin ve koni opsins1,2 gibi işlevsel olarak farklı Retina hücre tiplerinin yoğunluğu ve boyutu degradeler vardır son keşifler ortaya ,3,4,5. Sonuç olarak, retina yönünü belirlemek için kullanılan yöntemi içeren hücre türü veya opsin dağıtımları2,3,6, deneysel sonuçları etkileyebilecek yönde yön-seçmeli olarak ayarlama ganglion hücreleri7,8,9ve Retina dejenerasyonu10,11,12,13,14 topografik desenleri . Aslında, değil raporlama nasıl Retina yönlendirme bildirilmektedir tutarsızlıkları edebiyat ve karışıklık çalışmalar arasında verileri karşılaştırmak çalışırken neden olabilir. Bu nedenle araştırmacılar bu tür çalışmaların sonuçları doğru bir şekilde yorumlanabilir için retina yönünü belirleme yöntemi rapor hayati önem taşımaktadır.
Retina yönlendirme sık oküler enükleasyon1,3,12,15,16,17 önce sırt, Menfez, burun veya zamansal kornea Puanlama tarafından tanımlanır ,18,19 veya kesme veya ekstraoküler kaslar6,7gibi simge yapılara derin anatomik göz boyama, koroid fissür20,21, ya da s-opsin degrade2,3. Rektus kasları superior rektus, inferior rektus, medial rektus veya lateral rektus kas, ekin ya bisects bir derin giderici kesim yaparak sırt, Menfez, burun kemiği ve zamansal retina sırasıyla tanımlamak için kullanılabilir. Ancak, çoğu deneyler için bir rektus kas kullanarak retina22yönlendirme için yeterli olur. Göz geliştirme kalıntısı olan choroid yarığın göz arkasında zayıf yatay bir çizgi olarak görülebilir. Bu satır her sonu burun veya küre23zamansal kutup sona erer. Son olarak, s-opsin ifade asimetrik olarak farelerde ventral retina dağıtılır ve s-opsin antikorlar immunohistokimyasal deneyleri1ventral retinada ortaya çıkarmak için kullanılabilir.
Son eseri Stabio, vd. 22 kornea yanığı gibi yüzeysel oküler simge yapılara anatomik uzaydaki insan hatası ve zamansal ve medial kullanırken kornea yanığı yapımında değişkenlik nedeni büyük olasılıkla retina yönlendirme için daha az güvenilir bir yöntem olduğunu gösterdi referans noktaları olarak canthi. Buna ek olarak, derin tarihi yerler, superior rektus kas, choroid fissür ve s-opsin gradyan gibi retina22yönlendirme için daha güvenilir ve doğru yerlerinden olmak gösterilmiştir. Ancak, bu anatomik yerlerinden tanımlaması literatürde ayrıntılı olarak açıklanan değildir benzersiz diseksiyon adımları gerektirir. Böylece, bu iletişim kuralının amacı doğru fare retina kayma yönünü belirlemek için superior rektus kas, choroid fissür ve s-opsin degrade kullanımı hakkında kapsamlı bir eğitim sağlamaktır. Buna ek olarak, iki s-opsin antikorlar yanı sıra s-opsin immünhistokimya için bir iletişim kuralı etkinliğinin karşılaştırılması dahil ettik.
Bir ek meydan okuma çalışmaları üzerinde hassas Retina yönlendirme güvenerek wholemount Retina kayıt odası, yemek veya slayt üzerindeki düzleştirmek için gerekli büyük giderici kesim olduğunu. Bu düz iki boyutlu bir yapı olarak yansıması zaman doğal olarak bir üç boyutlu yapısı nedir analiz için sorunlar ortaya çıkarabilir. Retistruct24 adlı bir program–dan o toplanan verilerin analiz önce düz wholemount retina üç boyutlu yapısını dönmek için kullanılabilir. Böylece, bu iletişim kuralı bir bölümünü s-opsin immunostained fare Retina yeniden oluşturmak için Retistruct yazılım kullanmak için gerekli olan adımları vurgulama için adamıştır. Protokolü was gelişmiş-e doğru döndür ve şark fare Retina s-opsin ile lekeli bizim özel MATLAB komut kullanmak için bir bölümü de dahil ettik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belirlenmesi ve anatomik alanı izole fare retinada yönünü etiketleme için kapsamlı, standart protokol olmuştur. Protokol burada girişimleri standartlaştırılması tarafından bu boşluğu doldurmak için detaylı ve derin anatomik işaretlerini kullanmak nasıl ayrıntılı noktalarına güvenilir bir şekilde referans olarak tanımlamak Retina yönlendirme. Bu iletişim kuralı derin anatomik simge yapılar fare retina kornea yanığı22gibi yüzeysel simge yapılara daha yönlendirme için daha doğru ve güvenilir bir yöntem sağlamak gösterilmiştir. Böylece, Retina yönlendirme kornea yanığı dayanıyordu çalışmalar büyük hataları rektus kasları ve choroid fissür gibi simge yapılara dayanıyordu çalışmalar daha yönde vardı olabilir. Bu tutarsızlık ihtiyacını ve sonuçları yorumlama ve doğru Retina yönlendirme bağlı çalışmalar arasında karşılaştırmalar yapma ile ilgili bu standart iletişim kuralı önemini vurgulamaktadır. Genel olarak, standart bir protokol böylece oluşabilecek veri toplama karıştırıcı bir değişkende varlığıyla Retina tanımlamak için standart dışı yöntemlerin kullanımı ortadan kaldırarak vizyon araştırmacılar takip etmek için kullanılan genel yöntem sağlar Yönlendirme.
Burada sunulan kolayca tekrarlanabilir ve deneysel protokoller birçok türleri için geçerli yöntemlerdir. Aslında, bu protokolü en büyük avantajlarından biri, uyum yeteneği var. Choroid fissür, s-opsin ifade ve rektus kas yerler tüm güvenilir Retina yönlendirme22 tanımlamak için bulunmuştur çünkü en deneysel parametreleri uygun Simgesel Yapı veri toplama (tablo en iyi duruma getirmek için seçilebilir 1). Buna ek olarak, diseksiyon yöntemleri retina yönünü daha da netleştirmek için kombine edilebilir. Örneğin, choroid fissür kesim s-opsin immünhistokimya ile tüm dört Polonyalılar Retina yönlendirmek için kombine edilebilir: burun ve temporal hemisferlerin choroid fissür kesim tarafından belirlenebilir ve s-opsin immünhistokimya teşhis ventral ve dorsal hemisferlerin. Henüz, bu protokol adaptasyon Fizyoloji deneyler zamana duyarlı doğa tarafından sınırlı. O bir dönüm noktası belirlemek, kornea yanmak yapmak ve giderici bir kesim yürütmek için gereken zaman ex vivo deneyler önemli doku ölümüne neden olabilir çünkü bu diseksiyon yöntemlerden bazıları az en uygun olabilir. Neyse ki, bir tetkik derin işaretlerini belirleme ve rahatlatma yapma choroid çatlak veya superior rektus kas diseksiyon yöntemi ile tanıdık haline gelmiştir sonra kesim hızla diseksiyon rutin bir parçası haline ve önemli ölçüde eklemeyin diseksiyon uzunluğu için. Her ne kadar biz burada ayrıntılı adımları zamanında son derece zamana duyarlı deneyler için ekleyebilirsiniz kabul ediyor musunuz, doku canlılığı artık bir sorun (Şekil 3 olduğunda s-opsin degrade hoc sonrası Retina yöndür kullanmanızı öneririz ). S-opsin retina, yönlendirmek için etkili bir yol için dört Polonyalılar tanımlayabilirsiniz gibi retina boyama: s-opsin boyama retina dorsal ve ventral direkleri böler ve bağlı olarak burun ve zamansal Polonyalılar için sağlar retina sağ veya sol göz (Şekil 3) var. Bu nedenle, bu iletişim kuralını yöntemleri deneysel parametrelerin yerine getirebilecek doğru Retina yönlendirme için güvenilir ve yinelenebilir bir dizi sağlar inanıyoruz.
Olarak değiştirilmiş herhangi bir retina diseksiyon ile tetkik ve izole edildikten doku kalitesi doğruluğunu tarafından diseksiyonu yöntemin geçerliliğini sınırlıdır. Herhangi bir doku diseksiyon sırasında kaybolur veya bir retina çok doğru yeniden yapılanma için ezilmiş, Retistruct ve MATLAB programı güvenilir bir şekilde yeniden inşa veya retina yönlendirmek mümkün olmayacaktır. Bu nedenle veri toplamak için kullanarak deneyler önce diseksiyon yöntemi uygulama önemlidir. Burada zor değildir diseksiyonlarının türleri açıkladı iken, onlar belirli bir dönüm noktası ile retina yönlendirme tanımlama tekrarlanabilirlik sağlamak için uygulanan gerekir. Ayrıca, görsel olarak doğru landmark emin olmak için veri toplama başlamadan önce anatomik işaretlerini belirleme tetkik pratik kullanılıyor esastır. Ya choroid fissür yapmak için keser veya superior rektus kas keser ve beri sabit bir işaretleyici ve böylece dissectio doğruluğu üzerinde bağımlı değildir seyiyor s-opsin gradyan için kesim karşılaştırmak belirli bir tetkik doğruluğunu kontrol etmenin bir yolu olduğunu n. potansiyel dissectors Ayrıca kesim Şekil 1 ‘ de gösterilen doğru Simgesel Yapı ile yeniden oluşturulan Retina örnekleri için yeniden oluşturulan onların Retina karşılaştırmak ve Şekil 2. Esasen, potansiyel bir tetkik belirli diseksiyon türü için bu protokolü bölümünde özetlenen adımları gerçekleştirmeniz gerekir, bu olsun superior rektus kas veya koroid fissür yöntemi ve geçerliliğini kurmak için s-opsin geçişin sonuçları karşılaştırmak bir belirli tetkik. Tetkik Simgesel Yapı konumu hakkında emin değilseniz ise, retina bir yanlış yönde neden olabilir çünkü olacak, varsayılan olarak, veri toplama ve etkiler yorumu.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Brittany gün ve onların teknik destek için Jessica Onyak ve Dr. Liu nazik onun epifluorescent mikroskop kullanmamıza izin verdiğin için teşekkür etmek istiyorum. Destek bildirimleri: NIH R15EY026255-01 ve Karl Kirchgessner Vakfı.
Materials
| 0.1 M Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5244 | |
| Axioplan2 Epifluorescent Microscope | Zeiss | N/A | |
| Clear Nailpolish | N/A | N/A | |
| Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
| Costar TC-Treated 24-well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Donkey anti-Goat Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
| Donkey anti-Rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Donkey Normal Serum | Millipore | 566460 | Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Goat anti-s-opsin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Not commerically available as of 2017 |
| Graefe Curved Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| ImageJ or FIJI | National Institute of Health | N/A | Freely available software |
| Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | At least version 2007b or later |
| Micro Cover Glasses | VWR International | 48393-241 | |
| Micro Slide Trays | VWR International | 82020-913 | |
| Moira Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Nitrocellulose membrane | Millipore | HAWP04700 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative) |
| PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
| Pyrex Glass Petri Dish | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
| R | The R Project for Statistical Computing | N/A | Freely available software; version 3.4.3 or later |
| Rabbit anti-s-opsin | Millipore | ABN1660 | |
| Retiga R3 Microscope Camera | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
| Retistruct | N/A | N/A | Freely available software compatiable with Windows 7 or Windows 10 |
| Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution) |
| Vannas Spring Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| 5MP USB Microscope Digital Camera | AmScope | MU500 | To be used with the Olympus Dissection Microscope |
Referências
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
- Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina. Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).
- Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina. J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).
- Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).
- Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina. Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).
- Valiente-Soriano, F. J., et al. Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina. Front Neuroanat. 8, 131 (2014).
- Sabbah, S., et al. A retinal code for motion along the gravitational and body axes. Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).
- Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function. Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).
- Huberman, A. D., et al. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).
- Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Maiorano, N. A., Hindges, R. Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map. Nat Commun. 4, 1938 (2013).
- Hadj-Said, W., et al. Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).
- Tao, Y., et al. The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina. Sci Rep. 5, 18612 (2015).
- Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).
- Estevez, M. E., et al. Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision. J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses. J Vis Exp. (61), (2012).
- Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts. Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).
- Ortin-Martinez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
- Zhang, H., et al. The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice. J Ophthalmol. 2017, 9721362 (2017).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Wang, J., et al. Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. J Comp Neurol. 526 (11), (2018).
- Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup. Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).
- Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package. PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).
