JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Neurociência

Hvor du klippe saker: En disseksjon og analyse Guide romlig orientering musen netthinnen fra okulær landemerker

Published: August 04, 2018
doi:
10.3791/57861
, , , ,
1Department of Biology,The University of Akron, 2Department of Cell and Developmental Biology,University of Colorado Denver

Summary

Denne protokollen gir en omfattende disseksjon og analyse guide for bruk av dypt okulær landemerker, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct og egendefinerte koden nøyaktig og pålitelig orientere isolert musen netthinnen i anatomiske plass.

Abstract

Nøyaktig og pålitelig identifiserer romlig orientering av netthinnen som isolert mus er viktig for mange studier i visuell nevrovitenskap, inkludert analyse av tetthet og størrelse graderinger retinal celletyper, retning tuning av retning-selektiv ganglieceller, og behandlingen av topografiske degenerasjon mønstre i noen retinal sykdommer. Men det er mange forskjellige okulær disseksjon metoder rapportert i litteraturen som brukes til å identifisere og merke retinal orientering i musen netthinnen. Mens metoden for papirretning brukes i slike studier er ofte oversett, kan ikke rapportere hvordan retinal retning bestemmes føre til avvik i litteratur og forvirring når prøver å sammenligne data mellom studier. Overfladisk okulær landemerker som hornhinnen burns er brukt, men har nylig vist seg å være mindre pålitelig enn dypere landemerker som rectus musklene, choroid sprekken eller s-opsin graderingen. Her gir vi en omfattende guide for bruk av dypt okulær landemerker til nøyaktig analysere og dokumentere den romlig orienteringen av en isolert musen netthinnen. Vi har også sammenlignet effekten av to s-opsin antistoffer og inkludert en protokoll for s-opsin immunohistochemistry. Fordi retningen på netthinnen ifølge graderingen som s-opsin krever retinal gjenoppbygging med Retistruct programvare og rotasjon med egendefinert kode, har vi presentert viktig trinn kreves for å bruke begge disse programmene. Samlet er mål denne protokollen å levere en pålitelig og repeterbare sett med metoder for nøyaktig retinal orientering som tilpasses mest protokoller. En overordnede målet med dette arbeidet er å standardisere retinal retning metoder for fremtidige studier.

Introduction

En viktig og noen ganger oversett del av netthinnens nevrovitenskap er riktig retning og analyse av isolerte hele-mount netthinnen, enten det er retningen for en netthinnen i en elektrofysiologi opptak kammer eller på en histologiske lysbildet. Dette er spesielt viktig for studier med musen netthinnen, som er den mest brukte modellen for undersøkelser av pattedyr visuelle systemet. Nyere funn avsløre at musen netthinnen er ikke romlig uniform men har tetthet og størrelse graderinger funksjonelt forskjellige retinal celletyper, for eksempel melanopsin ganglieceller og forbigående OFF-alfa ganglieceller membran opsins1,2 ,3,4,5. Følgelig metoden brukes til å bestemme retningen på netthinnen kan påvirke de eksperimentelle resultatene som involverer celle type eller opsin distribusjoner2,3,6, retning tuning av retning-selektiv Ganglion celler7,8,9og topografiske mønstre retinal degenerasjon10,11,12,13,14 . Faktisk kan ikke rapportering hvordan retinal retning rapporteres føre til avvik i litteratur og forvirring når prøver å sammenligne data mellom studier. Det er derfor viktig at forskere rapporterer metoden for å identifisere retningen på netthinnen slik at resultatene av slike studier nøyaktig kan tolkes.

Netthinnen orientering er vanligvis identifisert av scoring dorsal, ventral, nese eller temporal hornhinnen før okulær enucleation1,3,12,15,16,17 ,18,19 eller ved skjæring eller flekker dypt anatomiske øye landemerker som extraocular musklene6,7, akkord sprekken20,21, eller s-opsin gradient2,3. Rectus musklene kan brukes til å identifisere dorsal, ventral, nese, og tidsmessige netthinnen ved å gjøre en dyp lindrende kutt som bisects feste enten den overlegen rectus, dårlig rectus, mediale rectus eller lateral rectus muskelen, henholdsvis. Men for de fleste eksperimenter er bruker en rectus muskel tilstrekkelig for å orientere det Netthinne22. Choroid kom ut, som er en levning av øye utvikling, kan ses som en svak vannrett linje på baksiden av øyet. Hver ende av denne linjen avslutter en nasal eller temporal pole verden23. Endelig, s-opsin uttrykk fordeles asymmetrisk ventrale netthinnen i mus, og s-opsin antistoffer kan brukes å avsløre ventrale netthinnen i immunohistochemical eksperimenter1.

Siste verk av Stabio, et al. 22 vist at overfladisk okulær landemerker som hornhinnen burns er mindre pålitelig metode for orientere netthinnen i anatomiske plass, mest sannsynlig skyldes menneskelige feil og variasjon i å gjøre korneal brenne når du bruker timelige og mediale canthi som referansepunkter. Derimot vist dyp landemerker, som overlegen rectus muskelen, choroid sprekken og s-opsin gradient, seg å være mer pålitelig og nøyaktig landemerker for å rette inn de Netthinne22. Identifikasjon av disse anatomiske landemerker krever imidlertid unik disseksjon trinn som ikke er beskrevet i detalj i litteraturen. Dermed er målet med denne protokollen å gi en omfattende opplæring om hvordan du bruker overlegen rectus muskel, choroid sprekken og s-opsin gradering å nøyaktig identifisere den romlig orienteringen av netthinnen som musen. I tillegg har vi inkludert en sammenligning av effektiviteten av to s-opsin antistoffer, samt en protokoll for s-opsin immunohistochemistry.

En ekstra utfordring å studies stole på presis retinal orientering er store lindrende kutt nødvendig å flate wholemount Netthinne i innspillingen kammer, rett eller lysbilde. Dette kan presentere utfordringer for analyse av hva er naturligvis en tredimensjonal struktur når det er avbildet som en flat, todimensjonal struktur. Et program kalt Retistruct24 kan brukes til å returnere en flat wholemount netthinnen til tredimensjonale strukturen før data samlet fra det er analysert. Dermed er en del av denne protokollen dedikert til fremheving trinnene som er nødvendig for å bruke Retistruct programvaren for å rekonstruere s-opsin immunostained mus netthinne. Vi har også inkludert en del av protokollen for bruk våre egendefinerte MATLAB script, som ble utviklet for å nøyaktig rotere og orientere musen Netthinne med s-opsin.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av The University of Akron. 1. Bruk overlegen Rectus muskel landemerket å identifisere Retinal orientering Merk: Overlegen rectus muskelen er et landemerke for dorsal netthinnen (tabell 1). Hvis eksperimentet ikke krever merking av dorsal netthinnen, hoppe over trinn 1 og fortsette til trinn 2. Følg godkjent institusjonelle Animal Care og bruk komiteen protokollen for musen euthanasia. For å identifisere den generelle retningen av verden, gjør en brenne merke på dorsal hornhinnen direkte mellom nese og tidsmessige canthi nær hornhinnen-sclera grensen umiddelbart etter euthanasia (figur 1A). Gjøre brenne merke ved å varme opp cautery penn i ti sekunder og deretter berøre tuppen av pennen dorsal hornhinnen for mindre enn et sekund.Merk: Holde cautery pennen hornhinnen for lenge vil føre verden å punktere.Merk: Mens noen cautery penner avgir lys, cautery pennen oppført i Tabell for materiale sender ikke noe lys når oppvarmet, noe som gjør det til et trygt alternativ for dark-adapted eksperimenter. For enucleation, kan du bruke buede tang forsiktig presse øyet ut av kontakten og grep verden fra under. Ikke klippe den optiske nerven å fjerne hele verden; i stedet sakte løfte verden fra kontakten mens du samtidig flytter den forsiktig fra venstre mot høyre til verden slippes fra kontakten.Merk: Denne bevegelsen vil tillate rectus musklene å være knyttet til verden når verden er endelig fjernet fra kontakten. Synsnerven vil også ofte være knyttet til verden. Overføre i verden med vedlagte rectus musklene i en Petriskål inneholder disseksjon medium. Sørg for å holde oversikt over hvilke øyne er venstre øye og som er høyre øye.Merk: Dissector bør bruke en passende disseksjon medium som passer med deres eksperimentelle protokollen. Under disseksjon omfang, visuelt finne dorsal hornhinnen brenne og identifisere overlegen rectus muskelen med som det er tilknyttet (figur 1A). Bruke disseksjon saks eller en 20 G (0,9 mm x 25 mm) p (se Tabell for materiale), punktering hornhinnen på brenne merket. Gjøre en dyp lindrende kutt i verden mot den optiske nerven å halvere overlegen muskelen. En isolert og rekonstruert netthinnen med dette kuttet vises tall 1B og 1 C. Begynn å isolere netthinnen ved hjelp av to sett med tang (se Tabell for materiale) å forsiktig rive hullet laget med punktering i trinn 1.6 til delen av netthinnen er utsatt.Merk: Det er viktig at dette gjøres forsiktig, som rive for kraftfullt kan forårsake lindrende kutt å rive ytterligere. Bruk tang til å erte hverandre netthinnen fra sclera til sclera har fjernet. Fjerne iris, linse, glasslegemet og eventuelle gjenværende strukturer med tang til netthinnen er fullstendig isolert.Merk: Protokollen kan pauses her. Hvis vevet skal være fast for s-opsin immunohistochemistry, fortsette til trinn 3.5. 2. Bruk Choroid sprekken landemerket å identifisere Retinal orientering Merk: Choroid sprekken på sclera på baksiden av øyet, og kjører timelige Pole til nasal pole (tall 2B og 2 C; Tabell 1). Følg godkjent institusjonelle Animal Care og bruk komiteen protokoll for musen euthanasia. For å identifisere den generelle retningen av verden, gjør en brenne merke på dorsal hornhinnen direkte mellom nese og tidsmessige canthi nær hornhinnen-sclera grensen umiddelbart etter euthanasia (figur 2A). Gjøre brenne merke ved å varme opp cautery penn i ti sekunder og deretter berøre tuppen av pennen dorsal hornhinnen for mindre enn et sekund.Merk: Holde cautery pennen hornhinnen for lenge vil føre verden å punktere. Enucleate øyet og overføre hele verden i en Petriskål inneholder disseksjon medium. Sørg for å holde oversikt over hvilke øyne er venstre øye og som er høyre øye.Merk: Dissector bør bruke en passende disseksjon medium som passer med deres eksperimentelle protokollen. Visuelt finne og identifisere choroid kom ut på baksiden av øyet (figur 2B, 2 C).Merk: Choroid sprekken er også synlig i eyecup under infrarødt lys20. Plasser verden i Petriskål slik at dorsal brenne ligger på den overlegne Polen, som det ville være hvis øyet var fortsatt i musen.Merk: Tilstedeværelsen av det dorsal brenne gir mulighet for identifisering av nese og tidsmessige siden av verden, som om det er en høyre eller venstre øye har dokumentert: Hvis det er en høyre øye, nasal choroid sprekken vil være til høyre for brenne og tempora l choroid sprekken blir til venstre for brenne. Hvis det er en venstre øye, timelige choroid sprekken vil være til høyre for brenne og nasal choroid sprekken blir til venstre for brenne.Bruke disseksjon saks eller en 20 G (0,9 x 25 mm) p (se Tabell for materiale), lage en punktering i verden der dorsal brenne ligger. Gjøre en grunne lindrende kutt mot synsnerven der dorsal hornhinnen brenne ligger. Dette kuttet blir vinkelrett choroid sprekken, tillater for identifikasjon av dorsal netthinnen etter isolasjon (figur 2D). De følgende to dypt lindrende kutt mot synsnerven: en av fôr bladene på dissection saks opp med timelige choroid sprekken linje på baksiden av øyet, og en av fôr bladene på dissection saks opp med nasal akkord sprekken linje på baksiden av øyet. Disse kutt vises på en isolert og rekonstruert netthinnen i figur 2D og 2E.Merk: Alternativt, et dypt kutt kan gjøres i timelige choroid rennen og et tynt kutt kan gjøres i nasal choroid sprekken, gjør dorsal hornhinnen brenne kutte unødvendige. Dette gir nøyaktig retningen på netthinnen med færre lindrende kutt. Begynn å isolere netthinnen ved hjelp av to sett med tang (se Tabell for materiale) å forsiktig rive hullet laget med punktering i trinn 2.7 og 2.8 til delen av netthinnen er utsatt.Merk: Det er viktig at dette gjøres forsiktig, som rive for kraftfullt kan forårsake lindrende Cut (e) å rive ytterligere. Bruk tang til å erte hverandre netthinnen fra sclera til sclera har fjernet. Fjerne iris, linse, glasslegemet og eventuelle gjenværende strukturer med tang til netthinnen er fullstendig isolert.Merk: Protokollen kan pauses her. Hvis vevet skal være fast for s-opsin immunohistochemistry, fortsette til trinn 3.5. 3. merking S-opsin forløpningen i musen netthinnen Merk: S-opsin photopigment uttrykket er asymmetrisk distribuert til ventrale netthinnen1, gjør den en utmerket markør for ventrale halvparten av netthinnen. Denne metoden er bare nyttig for fast og immunostained vev (tabell 1). Følgende trinn kan brukes på Netthinne som har blitt dissekert bruker noen av de nevnte metodene. Følg godkjent institusjonelle Animal Care og bruk komiteen protokoll for musen euthanasia. Umiddelbart etter dødshjelp, enucleate øyet og setter verden i en Petriskål med disseksjon medium. Sørg for å holde oversikt over hvilke øyne er venstre øye og som er høyre øye for å identifisere retinal orientering etter netthinnen er dissekert.Merk: Dissector bør bruke en passende disseksjon medium som passer med deres eksperimentelle protokollen. Begynn å isolere netthinnen ved hjelp av to sett med tang (tabell av materialer) å rive et hull i hornhinnen forsiktig til delen av netthinnen er utsatt.Merk: Det er viktig at dette gjøres forsiktig, som rive for kraftfullt kan forårsake netthinnen å rive. Bruk tang til å erte hverandre netthinnen fra sclera til sclera har fjernet. Fjerne iris, linse, glasslegemet og eventuelle gjenværende strukturer med tang til netthinnen er fullstendig isolert.Merk: Protokollen kan pauses her. Hvis bruker netthinnen for en ex vivo eksperimentere, gjennomføre eksperimentet før du utfører trinnene nedenfor. Bruker disseksjon saks, fire lindrende kutt i netthinnen slik at det vil ligge flatt. Montere den Netthinne ganglion celle-siden opp på nitrocellulose membran (Tabell for materiale) ved å trykke på hvert hjørne av netthinnen på membranen forsiktig med tang.Merk: Plasseringen av lindrende kutt kan være vilkårlig ved s-opsin graderingen for retinal orientering. Ved hjelp av pinsett, overføring montert netthinnen til den første brønnen i en 24-vel plate (Tabell for materiale) fylt med 1 mL av 4% paraformaldehyde (Tabell for materiale) for fiksering. Plasser 24-vel platen på en orbital shaker ved romtemperatur (Tabell for materiale) og fikse netthinnen for nøyaktig 40 min.Merk: Alle følgende vask og inkubasjon skal fullføres med 24-vel plate en orbital shaker. Vask netthinnen i 15 min ved romtemperatur ved å overføre den til andre godt fylt med 1 mL av 0.1 M PBS. Gjenta dette trinnet to ganger ved å overføre sekvensielt netthinnen til 0.1 M PBS-fylt tredje og fjerde brønnene. Overføre montert netthinnen til den femte tillegg inneholder 1 mL av blokkerer løsning (1,7% Triton X-100 og 5,2% esel normal serum i 0.1 M PBS, se Tabellen for materiale) og ruge over natten på 4 ° C. Legge kanin anti-s-opsin primære antistoffer (se Tabell of Materials) til blokkering løsning i en konsentrasjon av 1:500 og Inkuber i tre dager på 4 ° C. Vask overflødig primære antistoffer fra netthinnen seks ganger ved sekvensielt å plassere den i seks brønnene fylt med 1 mL av 0.1 M PBS i 10 minutter hver ved romtemperatur. Plasser netthinnen i en godt med frisk blokkerer løsning (1,7% Triton X-100 og 5,2% esel normal serum i 0.1 M PBS) og legge til esel anti-kanin Alexa-594 sekundære antistoff (se Tabell for materiale). Inkuber netthinnen med det sekundære antistoffet overnatting på 4 ° C. Vask overflødig sekundære antistoffer fra netthinnen seks ganger ved sekvensielt å plassere den i seks brønnene fylt med 1 mL av fersk 0.1 M PBS i 10 min hver ved romtemperatur. Bruke pinsett, overføre montert netthinnen til en Petriskål inneholder 0.1 M PBS. Utgivelsen netthinnen fra nitrocellulose membranen ved forsiktig å sette tips av Tang mellom netthinnen og membranen til netthinnen ikke lenger er koblet. Monter netthinnen på en barometer microscope skyve ved forsiktig prodding den med tang til netthinnen holder seg til glasset og fjerne lysbildet fra Petriskål. Dekker netthinnen på lysbildet med Aquamount og dekke det med en #1.5 dekkglassvæske. Plasser lysbildet i et lysbilde brett (se Tabell for materiale) og la den sitte i romtemperatur i en time. Tilbake lysbildet til kjøleskap og butikk i et lysbilde brett (se Tabell for materiale) på 4 ° C når den ikke er i bruk. Etter at lysbildet er coverslipped i 24 timer, kan du bruke neglelakk for å forsegle sidene av lysbildet for å hindre uttørking.Merk: Protokollen kan pauses her. 4. Bruk rekonstruert Netthinne Immunostained med S-opsin til å identifisere Retinal orientering Visualisere s-opsin graderingen AC confocal mikroskop eller en epifluorescent mikroskop med en kameraet vedlegg (se Tabell for materiale) og image netthinnen slik at hele netthinnen er synlig i ett bilde (tall 1B, 2D, 3A, og 3D). Dette kan gjøres ved imaging Netthinnen i seksjoner lav forstørrelse og deretter sette bildene sammen. Navnet netthinnen slik at de kan identifiseres. For eksempel kalle første netthinnen skal rekonstruert “Retina1”. Dataoverføre og installere ImageJ på https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Opprett en separat mappe for hver netthinnen som må bli rekonstruert, men la mappene være tom. For eksempel opprette en mappe kalt “Retina1”. Alle filene som trengs for å rekonstruere denne netthinnen plasseres i denne mappen i de etterfølgende trinnene.Merk: Bare filene mappene skal inneholde er filer som skal analyseres av Retistruct. Filer enn dem nedenfor vil gjøre netthinnen åpne av Retistruct. Åpne bildet av netthinnen i ImageJ ved å velge fil → åpne og deretter velge “Retina1”. Uten å endre bildet, lagre det som “image.png” til mappen med tittelen “netthinnen 1” ved å velge fil → lagre som → PNG.Merk: Filen må ha navnet “image.png” for Retistruct programvaren å gjenkjenne filen som en netthinnen gjenoppbygging. Bruk verktøyet for segmentert linje skissere kantene på netthinnen. Ved å klikke på to tilstøtende flekker på grensen av netthinnen, vil segmentert linje-verktøyet i hovedsak ” koble prikkene”mellom de to tilstøtende flekkene, lage en skisse. Gjenta til hele netthinnen har vært skissert. Lagre netthinnen disposisjonen som “outline.roi” til mappen med tittelen “Retina1” ved å velge analyser → verktøy → ROI manager → Legg [t] → mer → lagre.Merk: Kanten av netthinnen kan identifiseres hvor den s-opsin flekker overganger til bakgrunnen. Bruk verktøyet for segmentert linje som beskrevet i trinn 4.7 skissere grensen av fiberoptisk platen. Lagre blinde flekk disposisjonen som “od.roi” til mappen med tittelen “Retina1” ved å velge analyser → verktøy → ROI manager → Legg [t] → mer → lagre.Merk: Den blinde flekk som det lille hullet i midten av netthinnen, og vil variere avhengig av kvaliteten på disseksjon.Merk: Alle de nødvendige filene for Retistruct rekonstruksjon (“image.png”, “outline.roi” og “od.roi”) skal nå lagres mappen “Retina1”. Hvis du vil laste ned, installere og åpne programmet Retistruct, følg instruksjonene i brukerhåndboken Retistruct funnet i delen utfyllende materialer i Sterratt, et al. 24 Når Retistruct vinduet har dukket opp, klikk på “Åpne”-ikonet øverst til venstre i vinduet og velg mappen “Retina1”. En bildevindu vil komme opp som angir at det finnes ingen skala bar. Klikk på “Close” og et bilde av netthinnen vises i boksen. Visualisere omrisset av netthinnen ved å klikke på “Egenskaper”-knappen øverst til høyre i vinduet og endre omrissfarge til en synlig (figur 5et). VIKTIG: Angi om netthinnen er fra høyre øyet eller venstre øye i panelet til venstre (figur 5et). Klikk «Legg til tåre» på venstre, og angi hvor en tåre eller kutt er i netthinnen ved å klikke på de tre hjørnene av tåre (figur 5et). Dette vil opprette linjer som kobler de tre hjørnene på kuttet. Gjenta for alle kutt i netthinnen. Angi dorsal netthinnen ved å klikke på en vilkårlig punkt av netthinnen disposisjonen. Stor bokstav “D” vises på det punktet på omrisset (figur 5B).Merk: Dorsal netthinnen blir mørkere halvparten av netthinnen, midt imot s-opsin graderingen. Imidlertid er merke dorsal netthinnen i Retistruct ikke en pålitelig metode for å identifisere hudskjelettet av netthinnen, merking av “rygg” kan være vilkårlig i dette trinnet. Rekonstruere netthinnen ved å klikke “Rekonstruere netthinnen” øverst til venstre på skjermen (figur 5B). En polar tomt rekonstruert netthinnen vises med kutt i samme farge som disposisjonen (figur 5C). Klikk på “Lagre”-knappen til høyre på skjermen slik at rekonstruert netthinnen og alle de assosierte dataene er lagret i mappen “Retina1” mappen (figur 5D). Lagre rekonstruert netthinnen ved å klikke “PDF” i høyre panel (figur 5D). En boks vises ber om størrelse spesifikasjoner. Standardstørrelsen er akseptabelt for følgende. Denne handlingen vil lagre rekonstruert netthinnen som “image.polar.pdf” i mappen “Retina1”-mappen. Åpne “image.polar.pdf” i et tegneprogram (eller annet image manipulasjon program) og bruk “malingspannverktøyet” (eller lignende) å endre bakgrunnen av rekonstruert netthinnen til svart. Lagre rekonstruert netthinnen som en TIF-fil, for eksempel “Retina1_reconstructed.tif” i mappen “Retina1”-mappen.Merk: Protokollen kan pauses her. Last ned MATLAB kode for roterende netthinnen som kalles “Retina_Rotator.m” (se utfyllende materialer). Plassere koden arkiv i en egen mappe med ingen andre filer i mappen. Åpne MATLAB versjon 2007b eller senere. Dobbeltklikk på filen koden å åpne den i MATLAB. I vinduet Skriv inn “Retina_Rotator” og deretter trykke enter-tasten. Et søkevindu vises.Merk: Koden er spesifikke for TIF-filer. Hvis filen snus ikke er i riktig format, vil koden ikke rotere netthinnen riktig. Se trinn 4.17 og 4.18. for lagring rekonstruert netthinnen i riktig format. Åpne filen som skal roteres. For eksempel velge “Retina1_reconstructed.tif”. Koden vil deretter analysere rekonstruert netthinnen og lagrer automatisk rotert netthinnen som “Retina1_reconstructed_rotated.tif” i mappen hvor filen er plassert. Når koden er fullført analysere netthinnen, vises et vindu også viser bilder av netthinnen før og etter rotasjon for sammenligning (tall 3B og 3 C; Tall 3E og 3F).Merk: Denne koden roterer rekonstruert netthinnen ventrale (lyse) halvparten på bunnen og hudskjelettet (mørkeste) er på toppen, dermed innrettet nøyaktig netthinnen i henhold til s-opsin gradient1. Hvis enten netthinnen er fra en høyre øyet eller venstre øye har blitt dokumentert, kan også plasseringen av nese og tidsmessige polakkene ekstrapolert fra denne metoden av orientering (Figur 3).

Representative Results

En enkelt lindrende kutt som bisects overlegen rectus muskelen nøyaktig og pålitelig identifiserer dorsal netthinnen (figur 1). Choroid kom ut identifiserer nøyaktig og pålitelig nese og tidsmessige netthinnen med dype lindrende kutt langs timelige og nasal choroid rennen (figur 2). I dette eksemplet er en lindrende kutt også gjort i dorsal netthinnen for å identifisere dorsal/ventrale aksen av netthinnen (figur 2D, loddrett pil). Trinnene i disse prosessene vises for formålet med replikering av fremtidige dissectors. En kombinasjon av s-opsin immunohistochemistry (figur 3A og 3D), rekonstruksjon med Retistruct programvare (3B, 3E) og nøyaktig rotasjon med en egendefinert MATLAB kode (3 C, 3F) tillater det Identifikasjon av ventrale og dorsal halvdelene av netthinnen, samt nese og tidsmessige polakkene hvis det er kjent om netthinnen er fra en høyre eller venstre øye (Figur 3). Vi også sammenlignet to brukte s-opsin primære antistoffer for effektivitet i merking s-opsin kjegler (Figur 4A-D): begge Bukken anti-s-opsin primære antistoff og kanin anti-s-opsin primære antistoffer effektivt etikett s-opsin kjegler (Figur 4E) i samme musen. Lindre kutt ble identifisert på s-opsin immunostained rekonstruert Netthinne og plasseringene var forhold til retning bestemmes av s-opsin graderingen. Bruke våre custom MATLAB kode (se Supplerende materiale), netthinne var nøyaktig roteres slik at den høyeste konsentrasjonen av s-opsin flekker ligger ventrally, dermed plassere ekte dorsal på 90 ° (for overlegen rectus), sanne nasal ved 0 ° (for nese choroid sprekk) og sant timelige ved 180 ° (for timelige choroid sprekk). Verdien av hver enkelt lindrende kuttet vinkel var fast bestemt på å bruke verktøyet vinkel i ImageJ etter Netthinne ble rotert ifølge graderingen som s-opsin. En gjennomsnittlig vinkel ble beregnet for hver lindrende type kutting og den gjennomsnittlige verdien av hver lindrende kutt ble deretter plottet på polar tomten (figur 6). Gjennomsnittlig overlegen rectus muskler kutt identifisert dorsal stangen på 96.3 ± 4,3 ° (n = 11) (figur 6). Nasal choroid sprekken identifisert nasal stangen på 6,7 ± 5,8 ° og tidsmessige choroid sprekken identifisert timelige stangen på 172.0 ± 4.4° (n = 9; Figur 6). Figur 1: bruk av overlegen rectus muskelen å nøyaktig identifisere dorsal netthinnen av en høyre øye. (A) et eksempel på en dorsal hornhinnen brenne grensen til hornhinnen-Innbukking med en cautery merkepenn (hvit pil). Overlegen rectus muskelen er også synlig i denne visningen (hvit pil). (B) et eksempel av en hel montert netthinnen med en lindrende kutt laget i dorsal netthinnen av halverer overlegen rectus muskelen. Pilen viser dypet lindrende kutt laget i dorsal netthinnen av halverer overlegen rectus muskelen. Netthinnen er farget med primære antistoff geit anti-s-opsin (se Tabell for materiale) og sekundær antistoff esel anti-geit Alexa 594 (se Tabell for materiale; eksitasjon: 590 nm, utslipp: 620 nm) (cyan). Netthinnen ble avbildet med en epifluorescent mikroskop med en Texas rød filter (595 nm). (C) en netthinnen rekonstruert i Retistruct og roteres med en egendefinert MATLAB kode (se Supplerende materiale) med den overlegne rectus muskel lindrende kuttet synlig (hvit pil). D: rygg, V: ventral, T: timelig, N: nese. Skalere barer = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2: bruke choroid sprekken å nøyaktig identifisere nese og tidsmessige polakkene av netthinnen av en høyre øye. (A) et eksempel på en dorsal hornhinnen brenne grensen til hornhinnen-Innbukking med en cautery merkepenn. (B) på akkord sprekken vises på baksiden av øyet på sclera (hvit pil). Dorsal hornhinnen brenne er også synlig i denne visningen, ligger ca 90° timelige choroid kom ut. (C) på akkord sprekken vises på baksiden av øyet på sclera, reiser fra synsnerven hornhinnen-Innbukking grensen. (D) en netthinnen beiset med geit anti-s-opsin (se Tabell for materiale) og sekundær antistoff esel anti-geit Alexa 594 (se Tabell for materiale; eksitasjon: 590 nm, utslipp: 620 nm) (cyan) med choroid sprekken kutt (vannrett piler) og dorsal lindrende kuttet (loddrett pil). Netthinnen ble avbildet med en epifluorescent mikroskop med en Texas rød filter (595 nm). (E) en netthinnen rekonstruert i Retistruct og roteres med en egendefinert MATLAB kode (se supplerende materiale) med dorsal lindrende klipp og nese og tidsmessige choroid sprekken kutt synlig (hvite piler). D: rygg, V: ventral, T: timelig, N: nese. Skalere barer = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3: bruke graderingen som s-opsin til å identifisere alle fire stolper av netthinnen. (A) et eksempel på en netthinnen dissekert fra en høyre øye som er immunostained å merke s-opsin og fotografert med en epifluorescent mikroskop med en Texas rød filter (595 nm). Kutt i denne netthinnen er vilkårlig topografiske retning bestemmes av s-opsin graderingen. (B) resultatene av rekonstruere netthinnen i med Retistruct. Legg merke til at s-opsin graderingen ikke er riktig justert fordi netthinnen ikke har kjørt gjennom egendefinert MATLAB koden (se Supplerende materiale). (C) resultatene av roterende netthinnen i A med den egendefinerte koden. Netthinnen er rotert slik at den høyeste konsentrasjonen av s-opsin flekker er nederst og identifisert som det ventrale retinal. Netthinnen er fra en høyre øye, timelige stangen er plassert 90° mot klokken dorsal Pole og nasal stangen er plassert 90° med klokken dorsal Pole. (D) et eksempel på en netthinnen dissekert fra en venstre øye som er immunostained å merke s-opsin og fotografert med en Texas rød filter (595 nm). Kutt i denne netthinnen er vilkårlig topografiske retning bestemmes av s-opsin graderingen. (E) resultatene av digitalt rekonstruere netthinnen i D med Retistruct. Legg merke til at s-opsin graderingen ikke er riktig justert fordi netthinnen ikke er rotert av den egendefinerte koden. (F) resultatene av roterende netthinnen i D med den egendefinerte koden. Netthinnen er rotert slik at den høyeste konsentrasjonen av s-opsin flekker er nederst og identifisert som det ventrale retinal. Netthinnen er fra en venstre øye, nasal stangen er plassert 90° mot klokken dorsal Pole og tidsmessige stangen er plassert 90° med klokken dorsal Pole. D: rygg, V: ventral, T: timelig, N: nese. Skalere barer = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4: sammenligning av to primære s-opsin antistoffer i merking s-opsin kjegler. (A) A netthinnen beiset med geit anti-s-opsin primære antistoffer (se Tabell for materiale). (B) andre netthinnen av samme musen beiset med kanin anti-s-opsin primære antistoff (se Tabell for materiale). (C) en representant regionen (0,1 x 0,1 mm2) fra en netthinnen farget med geit anti-s-opsin primære antistoffer. Bilde tatt på en epifluorescent mikroskopet på 40 X forstørrelse. (D) en representant regionen (0,1 x 0,1 mm2) fra en netthinnen beiset med kanin anti-s-opsin (se Tabell for materiale), en primær antistoff alternativ. Bildet ble tatt på en epifluorescent mikroskopet på 40 X forstørrelse. (E) begge antistoffer etiketten samme antall s-membran ytre segmenter fordi det er ingen vesentlig forskjell i antall immunopositive s-kjegler som er farget av geit anti-s-opsin og kanin anti-s-opsin på noen av de testede retinal eksentriske (n = 2; VARIANSANALYSE med post hoc Bonferroni test; p > 0,05). Skalere barer = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 5: en visuell veiledning for å bruke Retistruct programvaren for å rekonstruere Netthinne immunostained med s-opsin. (A) A netthinnen åpnet i Retistruct med omriss synlig og en “slitasje” lagt. Poeng av “Tåre” angis med lagt hvite pilene. Alle kutt i denne netthinnen er vilkårlig, som ingen bestemt landemerke ble brukt til å markere retinal retning under disseksjon. Viktig knappene er uthevet i rødt. (B) en netthinnen med alle “tårer” lagt og dorsal netthinnen identifisert med “D” i utkanten av netthinnen. Legg merke til at knappen “Rekonstruere netthinnen” er nå synlig. Viktig knappene er uthevet i rødt. (C) prosessen med å rekonstruere en netthinnen. Polar tomten av rekonstruert netthinnen vises til høyre, viser den lindrende kutt i cyan (blå piler lagt for å avklare kuttet steder). (D) det endelige resultatet av å kjøre en netthinnen gjennom Retistruct. Opprinnelige wholemount netthinnen fortsatt til venstre, og rekonstruert netthinnen vises til høyre. Lindre kutt er synlige i cyan (hvite pilene lagt for å avklare kuttet steder). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 6: overlegen rectus muskel og akkord sprekken kan brukes til nøyaktig orientere musen netthinnen. En polar tomt vinkler hentes fra enten overlegen rectus muskel lindrende kutt eller choroid sprekken kutt i Netthinne som er gjenoppbygget med Retistruct. Lindre kutt ble identifisert på s-opsin immunostained rekonstruert Netthinne og plasseringene var forhold til plasseringen av s-opsin graderingen. Bruker egendefinerte MATLAB koden nøyaktig rotere netthinnen slik at den høyeste konsentrasjonen av s-opsin flekker ligger ventrally, sant dorsal (90° for overlegen rectus), sant nese (0° for nasal choroid sprekk) og sant timelige (180° for timelige akkord sprekken) var bestemt for hver netthinnen. Verdien av hver individuelle lindrende kuttet vinkel ble bestemt i ImageJ og gjennomsnittlig vinkel ble beregnet for hver lindrende type kutting. Overlegen rectus muskler kutt identifisert dorsal stangen på 96.3 ± 4,3 ° (n = 11). Nasal choroid sprekken identifisert nasal stangen på 6,7 ± 5,8 ° og tidsmessige choroid sprekken identifisert timelige stangen på 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Dyp landemerke Hornhinnen brenne plassering Pol av netthinnen identifisert Eksperimentell program Overlegen Rectus Dorsal Dorsal Live eller fast Nasal Choroid sprekk Dorsal Nese Live eller fast Timelige Choroid sprekk Dorsal Timelige Live eller fast S-opsin gradering Ingen Dorsal, Ventral, nese, timelige Fast Tabell 1: Deep landemerker, Polen av netthinnen de identifisere, og om de kan brukes for live eller fast vev program.

Discussion

Det er ingen omfattende, standardisert protokoll for fastsettelse og merking retningen på isolerte musen netthinnen i anatomiske plass. Protokollen finnesher forsøk på å fylle dette tomrommet ved standardisering og detaljering hvordan du bruker dypt anatomiske landemerker som referansepunkter pålitelig identifisere retinal orientering. Det har vist at dypt anatomiske landemerkene i denne protokollen gir en mer nøyaktig og pålitelig metode for å orientere musen netthinnen enn overfladiske landemerker som hornhinnen burns22. Studier som har stolt på hornhinnen burns for retinal orientering kan dermed ha hatt større feil i retning enn studier som har stolt på rectus muskler og choroid sprekken. Dette avviket understreker behovet for og betydningen av denne standardisert protokollen forhold til tolke resultatene og foreta sammenligninger mellom studier som er avhengige av nøyaktig retinal orientering. Overall, en standardisert protokoll vil gi en vanlig måte visjon forskere å følge, dermed eliminere tilstedeværelsen av en forvirrende variabel i datainnsamling som kan oppstå med bruk av ikke-standardiserte metoder for å identifisere retinal orientering.

Metodene presenteres her er lett repeterbare og gjelder for mange typer eksperimentelle protokoller. Faktisk er en av de største fordelene med denne protokollen tilpasningsdyktighet sin. Fordi de choroid sprekken, s-opsin uttrykk og rectus muskel landemerker er funnet for å identifisere pålitelig retinal retning22 landemerket som best passer eksperimentelle parameterne kan velges å optimalisere datainnsamling (tabell 1). dessuten metoder for disseksjon kan kombineres for å ytterligere å klargjøre retningen på netthinnen. For eksempel choroid sprekken kutt kan kombineres med s-opsin immunohistochemistry for å orientere alle fire stolper av netthinnen: nese og tidsmessige halvkuler kan identifiseres ved choroid sprekken kutt og s-opsin immunohistochemistry kan identifisere ventrale og dorsal halvkuler. Likevel, tilpasningsevne denne protokollen kan være begrenset tid-følsom natur fysiologi eksperimenter. Fordi tiden det tar å identifisere et landemerke, gjøre en hornhinnen brenne og utfører en lindrende kutt kan føre til betydelig vev død ex vivo eksperimenter, kan det hende noen av metodene disseksjon optimalt. Heldigvis, når en dissector har blitt kjent med choroid sprekk eller overlegen rectus muskel disseksjon metoden, identifisere de dype landemerkene og gjør den lindrende kutt raskt bli en del av rutinen disseksjon og adderer ikke betydelig lengden på disseksjon. Selv om vi erkjenner at trinnene beskrevet her kan legge tidsnok til ekstremt tidssensitivt eksperimenter, foreslår vi bruke s-opsin graderingen for post hoc retinal orientering når levedyktigheten til vev er ikke lenger et problem (Figur 3 ). Flekker på netthinnen for s-opsin er en effektiv måte å orientere netthinnen, som det kan identifisere alle fire stolper: s-opsin flekker deler netthinnen i rygg- og ventrale polakker og tillater for identifikasjon av nese og tidsmessige stenger avhengig av om netthinnen er en høyre eller venstre øye (Figur 3). Derfor tror vi denne protokollen gir et pålitelig og repeterbare sett med metoder for nøyaktig retinal orientering som kan oppfylle eksperimentelle parametere.

Som med alle endrede retinal disseksjon, er gyldigheten av metoden disseksjon begrenset av nøyaktigheten i dissector og kvaliteten på vev som er isolert. Hvis noen vev går tapt under disseksjon eller en netthinnen er også lemlestede nøyaktig gjenoppbygging, kan Retistruct og MATLAB programmet ikke pålitelig rekonstruere eller orientere netthinnen. Det er derfor viktig å praktisere metoden disseksjon før bruker den for data-innsamling eksperimenter. Mens typene disseksjoner forklart her ikke er vanskelig, må de bli praktisert for å sikre repeterbarhet identifisere retinal retning og med et bestemt landemerke. Det er viktig at dissector praksis visuelt identifiserer anatomiske landemerkene før begynnelsen datainnsamling for å forsikre deg om at riktig landemerket brukes. En måte å sjekke nøyaktigheten av en bestemt dissector er å enten choroid sprekken kutt eller overlegen rectus muskler kutt og sammenlign plasseringen av kutt til s-opsin gradient, siden det er en fast og dermed er ikke avhengig av nøyaktigheten av dissectio n. potensielle dissectors kan også sammenligne deres rekonstruert Netthinne eksemplene av rekonstruert Netthinne med nøyaktig landmark kutt er vist i figur 1 og figur 2. I hovedsak en potensiell dissector skal utføre fremgangsmåten i denne protokollen for en bestemt disseksjon, enten det er overlegen rectus muskel eller akkord sprekken metoden, og sammenligner resultatene til s-opsin graderingen å etablere gyldigheten av en bestemt dissector. Fordi hvis dissector er usikker på om stedet av landemerke, det kan resultere i en feil retning av netthinnen som vil, som standard påvirker innsamling og tolkning.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke Brittany dag og Jessica Onyak for deres kundestøtte og Dr. Liu for vennlige la oss bruke hans epifluorescent mikroskop. Takk for støtte: NIH R15EY026255-01 og Karl Kirchgessner Foundation.

Materials

0.1 M Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich  P5244
Axioplan2 Epifluorescent Microscope Zeiss N/A
Clear Nailpolish N/A N/A
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker Sigma-Aldrich CLS6780FP
Costar TC-Treated 24-well Plates Sigma-Aldrich CLS3524
Dissection Microscope Olympus SZ51
Donkey anti-Goat Alexa 594 Life Technologies  A11058
Donkey anti-Rabbit Alexa 594 Life Technologies  A21207
Donkey Normal Serum Millipore 566460 Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Goat anti-s-opsin Santa Cruz Biotechnologies  sc-14363 Not commerically available as of 2017
Graefe Curved Forceps Fine Science Tools 11052-10
ImageJ or FIJI National Institute of Health N/A Freely available software
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer Bovie Medical Corporation AA00
MATLAB MathWorks N/A At least version 2007b or later
Micro Cover Glasses  VWR International 48393-241
Micro Slide Trays VWR International 82020-913
Moira Ultra Fine Forceps Fine Science Tools  11370-40
Nitrocellulose membrane Millipore HAWP04700
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)
PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm)  BD PrecisionGlide 305175
Pyrex Glass Petri Dish Sigma-Aldrich CLS3160152
R The R Project for Statistical Computing N/A Freely available software; version 3.4.3 or later
Rabbit anti-s-opsin Millipore ABN1660
Retiga R3 Microscope Camera Qimaging 01-RET-R3-R-CLR-14-C
Retistruct N/A N/A Freely available software  compatiable with Windows 7 or Windows 10
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media Fisher Scientific 14-390-5
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)
Vannas Spring Dissection Scissors  Fine Science Tools 15000-03
5MP USB Microscope Digital Camera AmScope MU500 To be used with the Olympus Dissection Microscope
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
  2. Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina. Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).
  3. Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina. J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).
  4. Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).
  5. Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina. Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).
  6. Valiente-Soriano, F. J., et al. Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina. Front Neuroanat. 8, 131 (2014).
  7. Sabbah, S., et al. A retinal code for motion along the gravitational and body axes. Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).
  8. Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function. Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).
  9. Huberman, A. D., et al. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).
  10. Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia. eNeuro. 3 (5), (2016).
  11. Maiorano, N. A., Hindges, R. Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map. Nat Commun. 4, 1938 (2013).
  12. Hadj-Said, W., et al. Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).
  13. Tao, Y., et al. The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina. Sci Rep. 5, 18612 (2015).
  14. Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).
  15. Estevez, M. E., et al. Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision. J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).
  16. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses. J Vis Exp. (61), (2012).
  17. Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts. Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).
  18. Ortin-Martinez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  19. Zhang, H., et al. The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice. J Ophthalmol. 2017, 9721362 (2017).
  20. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
  21. Wang, J., et al. Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
  22. Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. J Comp Neurol. 526 (11), (2018).
  23. Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup. Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).
  24. Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package. PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).

Tags

Mouse RetinaOcular LandmarksDissection ProtocolSpatial OrientationRetinal TopographyDorsalVentralNasalTemporalCorneal BurnRectus MusclesChoroid FissureS-opsin GradientEnucleationRetinal IsolationSclera RemovalIrisLensVitreousRight EyeLeft Eye

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Sondereker, K. B., Stabio, M. E., Jamil, J. R., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks. J. Vis. Exp. (138), e57861, doi:10.3791/57861 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image