事項をカットする場所: 郭清と眼のランドマークからマウス網膜の空間的なオリエンテーションの解析ガイド

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) アクロンの大学によって承認されています。 1. 網膜の方向を識別するのに上直筋ランドマークを使用 注: 上直筋、背側網膜 (表 1) のランドマークです。実験は、背側網膜の印を必要としない、手順 1 と手順 2 に進みます。 マウスの安楽死のため承認された機関動物ケアおよび使用委員会プロトコルに従ってください。 世界中の一般的な方向を識別するためにマーク直後に安楽死 (図 1A) 角膜強膜国境に近い鼻と時間の canthi の間で直接背側の角膜の火傷をします。火傷 10 秒間焼灼ペンを加熱し、1 秒未満の背側の角膜にペンの先端に触れることによってマークを確認します。注: 保持のため角膜を焼灼ペン長すぎるパンク グローブになります。注: いくつかの焼灼ペンは、光を発するか中、材料表に掲げる焼灼ペンは発光しないとき加熱、バクテリオロドプシンの実験のための安全なオプションとなっています。 眼球摘出、軽くソケットから目を押して、グリップの下からグローブにカーブタイプ鉗子を使用します。世界を削除する視神経を切断しないでください。代わりに、移動しながら同時に優しく左から右へ世界中がソケットから外れるまでにソケットから世界を持ち上げてゆっくりと。注: この動きは世界中がソケットから完全に削除される最後に世界に接続されたままに腹直筋になります。視神経もよく世界中に接続されたままになります。 郭清の媒体を含んでいるペトリ皿で接続されている腹直筋とグローブを転送します。目は左目、右目を追跡することを確認します。注: 切開は、彼らの実験的プロトコルと合わせて適切な解剖媒体を使用してください。 上直筋とを認識し、郭清範囲の下で視覚的に特定背側の角膜のやけどそれは関連付けられる (図 1A)。 解剖はさみを使ったり、20 G (0.9 mm × 25 mm) (材料の表を参照)、穿刺の針マークを燃やすで角膜。深い上筋を両断する視神経に向かって世界中にカットを緩和をします。このカットを分離し再構築した網膜は、図 1 bと1 Cに表示されます。 網膜の一部が公開されるまで手順 1.6 で穿刺した穴をそっと涙を鉗子 (材料の表を参照) の 2 つのセットを使用して網膜を分離を開始します。メモ: 重要ですさらに涙を緩和のカットを引き起こすことができますこれが優しく、あまり強く引き裂くとして行われます。 強膜が完全に削除されるまで、離れて強膜から網膜をいじめるに鉗子を使用します。網膜が完全に分離するまでは、鉗子で虹彩、レンズ、硝子体、および任意の残りの構造を削除します。注: プロトコルはここで一時停止可能性があります。組織は、s オプシン免疫組織化学的に修正するつもりですが場合、は、3.5 の手順に進みます。 2. 網膜の方向を識別するのに脈絡裂ランドマークを使用 注: 脈絡裂上の背中、目の強膜に存在は、(図 2 bおよび2 C鼻のポールに側頭極から実行表 1)。 マウスの安楽死のための承認された機関動物ケアおよび使用委員会プロトコルに従ってください。 世界中の一般的な方向を識別するためにマーク直後に安楽死 (図 2A) 角膜強膜国境に近い鼻と時間の canthi の間で直接背側の角膜の火傷をします。火傷 10 秒間焼灼ペンを加熱し、1 秒未満の背側の角膜にペンの先端に触れることによってマークを確認します。注: 保持のため角膜を焼灼ペン長すぎるパンク グローブになります。 目を摘出し、郭清媒体を含んでいるペトリ皿でグローブを転送します。目は左目、右目を追跡することを確認します。注: 切開は、彼らの実験的プロトコルと合わせて適切な解剖媒体を使用してください。 視覚的に検索して (図 2B, 2 C) 目の背面に脈絡裂を特定します。注: 脈絡裂、赤外線光20下アイカップ内部表示されますも。 目がマウスでまだされたかどうか、背側の書き込みは優れた極に位置して、ペトリ皿のグローブに合わせます。注意: 背の存在書き込みでグローブの鼻および時間的な面の識別は、かどうかそれは右または左の目がある限り記載されている: の場合右目、鼻の脈絡裂にやけどと、ロケーションの右側になりますl 脈絡裂に焼跡の左側になります。左目の場合は、一時的な脈絡裂に焼跡の右側になります、鼻の脈絡裂に焼跡の左側になります。解剖はさみを使ったり、20 G (0.9 x 25 mm) は背の熱傷がある世界の中で (材料の表を参照) を 1 つ穿刺を針します。 作る浅い緩和視神経に対する背側の角膜の火傷があります。このカットは分離 (図 2D) 後の背側網膜の同定を可能にする、脈絡裂に垂直になります。 視神経への次の 2 つの深い緩和カット: 解剖のブレードを並べて 1 つは、目の後ろに一時的な脈絡裂線をはさみし、郭清のブレードを並べることによって 1 つは鼻の脈絡膜とをはさみ目の後ろの割れ目ライン。これらのカットは、図 2Dと2 eで分離・再生網膜に表示されます。注: または、一時的な脈絡裂で深いカットを行うことができます、不要なカット背側の角膜のやけどを作る鼻の脈絡裂で浅いカットを行うことができます。これにより少ない緩和カットと網膜の正確な方向。 網膜の一部が公開されるまで手順 2.7 および 2.8 で穿刺した穴をそっと涙を鉗子 (材料の表を参照) の 2 つのセットを使用して網膜を分離を開始します。メモ: 重要ですさらに涙を緩和の cut(s) を引き起こすことができますこれが優しく、あまり強く引き裂くとして行われます。 強膜が完全に削除されるまで、離れて強膜から網膜をいじめるに鉗子を使用します。網膜が完全に分離するまでは、鉗子で虹彩、レンズ、硝子体、および任意の残りの構造を削除します。注: プロトコルはここで一時停止可能性があります。組織は、s オプシン免疫組織化学的に修正するつもりですが場合、は、3.5 の手順に進みます。 3. マウス網膜における S オプシン グラデーションのラベリング メモ: s オプシン光式、腹側網膜に1網膜の腹側の半分の優れたマーカーとなって分散非対称的。このメソッドは、固定の役に立つだけですと immunostained 組織 (表 1)。次の手順は、上記の方法のいずれかを使用して解剖されている網膜に適用できます。 マウスの安楽死のための承認された機関動物ケアおよび使用委員会プロトコルに従ってください。 安楽死、直後後目を摘出し、郭清培地でシャーレの世界を配置します。目は左目と右目は網膜の解剖後に網膜の方向を識別するために追跡することを確認します。注: 切開は、彼らの実験的プロトコルと合わせて適切な解剖媒体を使用してください。 網膜の一部が公開されるまで、優しく角膜に穴を引き裂く鉗子 (材料表) の 2 つのセットを使用して網膜を分離を開始します。注意: 重要です涙に網膜を引き起こすことができますこれが優しく、あまり強く引き裂くとして行われます。 強膜が完全に削除されるまで、離れて強膜から網膜をいじめるに鉗子を使用します。網膜が完全に分離するまでは、鉗子で虹彩、レンズ、硝子体、および任意の残りの構造を削除します。注: プロトコルはここで一時停止可能性があります。実験する前のヴィヴォの網膜を使用して場合は、次の手順を実行する前に実験を行います。 解剖はさみを使って、網膜の 4 つの緩和削減して、ようにそれは平ら。鉗子で膜上に網膜の各コーナーを軽く押すをニトロセルロース膜 (材料表) の網膜神経節細胞側をマウントします。メモ: 緩和カットの場所は、網膜の方向 s オプシンのグラデーションを使用するときに任意指定できます。 鉗子を使用すると、転送マウントされた網膜 24 ウェル プレート (材料表) の最初の井戸の中には固定用 4% パラホルムアルデヒド (材料表) の 1 つの mL でいっぱい。常温 (材料表) の軌道シェーカーで 24 ウェル プレートを置き、40 分正確に網膜を修正します。注: 次の洗浄と培養の手順のすべては軌道シェーカーで 24 ウェル プレートで完了する必要があります。 よく満ちている 1 mL の 0.1 M PBS 第 2 に転送して室温で 15 分間の網膜を洗います。2 回連続 0.1 M PBS いっぱい 3 番目と 4 番目の井戸に網膜を転送することによって、この手順を繰り返します。 ソリューション (1.7% トリトン X-100 および 5.2% ロバ血清 0.1 M PBS で;材料表参照) ブロックの 5 も含む 1 mL にマウントされた網膜を転送し、4 ° C で一晩インキュベート ウサギ抗のオプシンの一次抗体を追加 (材料の表を参照) 1: 500 の濃度の解決の妨害に、4 ° C で 3 日間インキュベート 六つの井戸を室温で 10 分ごとに 1 mL の 0.1 M PBS でいっぱいで順番に配置することによって 6 回網膜から余分な一次抗体を洗います。 新鮮なブロッキング液 (1.7% トリトン X-100 および 5.2% ロバ通常血清 0.1 M PBS) で井戸に網膜を配置し、ロバ抗家兎 Alexa 594 二次抗体を追加 (材料の表を参照してください)。4 ° C で一晩二次抗体と網膜を孵化させなさい 1 ml 室温で 10 分間新鮮な 0.1 M PBS の六つの井戸に順番に配置することによって 6 回網膜から余分な二次抗体を洗浄します。 鉗子を使用して、0.1 M PBS を含むシャーレにマウントされた網膜を転送します。網膜が添付されていないまで軽く網膜と膜間の鉗子の先端を挿入することによって硝酸セルロースの膜から網膜をリリースします。 網膜がガラスに付着するまで優しくで鉗子の肝いりでガラス顕微鏡スライドの網膜をマウントし、ペトリ皿からスライドを削除します。 Aquamount のスライドに網膜をカバーし、#1.5 coverslip でそれをカバーします。スライド トレイにスライドを配置 (材料の表を参照) し、室温で 1 時間放置します。 スライド トレイに格納しても冷蔵庫のスライドを返す (材料の表を参照) で使用しない場合は 4 ° C。スライドは 24 時間 coverslipped した後、乾燥を防ぐためにスライドの側面をシールするのにマニキュアを使用します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 4 網膜の方向を識別するために S オプシンと網膜 Immunostained を再構築. 共焦点顕微鏡とカメラの付いた epifluorescent 顕微鏡のオプシン グラデーションを可視化 (材料の表を参照) として網膜全体が表示されます(図 1 b、2 D、3 a、および1 つのイメージで、網膜をイメージ3 D). これは、低倍率でのセクションで網膜を画像と画像を一緒にステッチで行うことができます。 個人を特定できるので、網膜の名前を付けます。たとえば、名前に最初網膜再建”Retina1″。 ダウンロードし、https://imagej.nih.gov/ij/download.html で ImageJ をインストールします。 再建されるが、フォルダーを空のままにする必要がありますそれぞれの網膜の個々 のフォルダーを作成します。たとえば、”Retina1″というフォルダーを作成します。この網膜を再構築に必要なすべてのファイルは、以降の手順でこのフォルダーにされます。注: これらのフォルダーを含める必要がありますファイルのみ、Retistruct で分析することをファイルです。下記のもの以外のファイルは Retistruct ソフトウェアで開くことができませんの網膜になります。 ファイルを選択する ImageJ で網膜の画像を開く →「Retina1」を選択すると開く。 画像に変更を加えず、タイトルのフォルダーに”image.png”として保存”網膜 1「ファイル → 名前を付けて保存 → png 形式を選択します。注: ファイルを Retistruct ソフトウェア再構成のため網膜としてファイルを認識するために”image.png”という必要があります。 網膜の端を説明するには、セグメント化された [線] ツールを使用します。網膜の境界線の 2 つの隣接するスポットをクリックして、分割線] ツールは、本質的に「つなぐドット」アウトラインを作成する 2 つの隣接するスポット。繰り返して、全体の網膜に概説されています。網膜のアウトラインを分析を選択することによって”Retina1″のタイトルのフォルダーに”outline.roi”として保存 → ツール → ROI マネージャーは保存 → [t] → を追加します。注: 網膜の端は、バック グラウンドに移行 s オプシン染色識別できます。 4.7 のステップの指示通り、視神経乳頭の境界線のアウトラインを作成するのに分割線] ツールを使用します。視神経乳頭のアウトラインを分析を選択することによって”Retina1″のタイトルのフォルダーに”od.roi”として保存 → ツール → ROI マネージャーは保存 → [t] → を追加します。注: 視神経乳頭、網膜の真ん中に小さな穴として識別され、郭清の品質によって異なります。注: すべてのファイル (“image.png”、”outline.roi”、”od.roi”) Retistruct 復興のため必要今保存してくださいフォルダー”Retina1″。 ダウンロード、インストール、および Retistruct プログラムを開くするには、Sterrattらの補足資料セクションにある Retistruct ユーザー ガイドで説明されている手順に従います24 ウィンドウが登場して、Retistruct をクリックして上部に「オープン」のアイコン ウィンドウの左し、”Retina1″ディレクトリ フォルダーを選択します。 スケール バーが存在しないことを示す画像ウィンドウが表示されます。「閉じる」をクリックし、網膜のイメージがボックスに表示されます。上にある「プロパティ」ボタンをクリックしてして網膜のアウトラインを視覚化する表示色 (図 5A) ウィンドウと変更の輪郭線の右。 重要: 網膜が右目または左 (図 5A) のパネルに左目からかどうかを指定します。 左側の「涙を追加」ボタンをクリックしてし涙またはカットの涙 (図 5A) の 3 つ頂点をクリックして網膜のある場所を指定します。これはカットの 3 つの頂点を接続する線を作成します。網膜にあるすべてのカットに対して繰り返します。 網膜のアウトラインの任意の点をクリックして、背側の網膜を指定します。大文字の文字”D”は、アウトライン (図 5B) にその時点で表示されます。注意: 背側の網膜のオプシン グラデーションの反対側の網膜の暗い半分になります。ただし、Retistruct で背側網膜のマーキングは「背」のマーキングはこのステップで任意にすることができますので、網膜の背側半分を識別するための信頼性の高い方法ではありません。 上部に「網膜の再構築」ボタンをクリックして網膜左画面 (図 5B) の再構築。再建された網膜の極座標は、カットの概要 (図 5C) と同じ色で表示されますが表示されます。 再建された網膜およびすべてのそれに関連付けられているデータは”Retina1″フォルダー (図 5D) に保存されますので、画面の右上の「保存」ボタンをクリックしてします。 再建された網膜を保存するには、右側のパネル (図 5D) の”PDF”ボタンをクリックします。サイズ仕様を求めるボックスが表示されます。既定のサイズは次の手順のために許容します。このアクションは、”Retina1″フォルダー ディレクトリに”image.polar.pdf”として再建された網膜が保存されます。 ペイント プログラム (またはその他のイメージの処理プログラム) で「image.polar.pdf」を開き、「ペイント」ツールを使用して (または類似の) 再建された網膜背景黒に変更します。”Retina1″フォルダー ディレクトリに”Retina1_reconstructed.tif”などの .tif ファイルとして再構築した網膜を保存します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 “Retina_Rotator.m”(補足資料を参照) と呼ばれる網膜を回転させるための MATLAB のコードをダウンロードしてください。独自のフォルダーでコード ファイルを配置フォルダーに他のファイルはないです。 MATLAB、バージョン 2007 b を開くまたはそれ以降。MATLAB で開くコード ファイルをダブルクリックします。コマンド ウィンドウで”Retina_Rotator”を入力し、enter キーを押します。検索ウィンドウが表示されます。注: コードは、.tif ファイルの特定です。回転するファイルが正しい形式でない場合、コードが網膜を正しく回転しないでしょう。4.17 と 4.18 の手順を参照してください。適切な形式で再建された網膜を保存します。 回転するファイルを開きます。たとえば、”Retina1_reconstructed.tif”を選択します。コード再建された網膜を分析し、自動的に元のファイルのあるフォルダーに”Retina1_reconstructed_rotated.tif”として回転した網膜を保存します。 コードの網膜の分析が完了すると前に、と後の比較 (図 3 bと 3 C回転網膜の画像を表示ウィンドウが開きますも図 3E 、 3 f)。注: このコードは、腹側 (明るい) 半分が下、背 (明度) 半分従って正確に定位 s オプシン グラデーション1によると網膜の上に再建された網膜を回転します。場合は網膜が右目から左目が記載されているか、鼻と一時的な棒の置き場所も向き (図 3) のこのメソッドから推定できます。