JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Waar je knippen zaken: Een dissectie en analyse-gids voor de ruimtelijke oriëntatie van het netvlies muis van oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden

Published: August 04, 2018
doi:
10.3791/57861
, , , ,
1Department of Biology,The University of Akron, 2Department of Cell and Developmental Biology,University of Colorado Denver

Summary

Dit protocol biedt een uitgebreide dissectie en analyse gids voor het gebruik van diep oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct en aangepaste code nauwkeurig en betrouwbaar oriënteren het netvlies geïsoleerde muis in anatomische ruimte.

Abstract

Nauwkeurig en betrouwbaar identificatie van ruimtelijke oriëntatie van het netvlies geïsoleerde muis is belangrijk voor vele studies in visuele neurowetenschappen, met inbegrip van de analyse van de dichtheid en gradiënten van de grootte van de retinale celtypes, de afstemming van de richting van richting-selectieve ganglion cellen, en het onderzoek van topografische degeneratie patronen in sommige retinale ziekten. Echter, er zijn vele verschillende oogbeschadigingen en/of dissectie methoden die worden gemeld in de literatuur en die worden gebruikt voor het identificeren en label retinale oriëntatie in het netvlies van de muis. Terwijl de methode van oriëntatie gebruikt in dergelijke studies vaak vergeten wordt, geen rapportage hoe retinale oriëntatie wordt bepaald kan leiden tot verschillen in de literatuur en de verwarring wanneer u probeert om gegevens tussen studies te vergelijken. Oppervlakkige oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden zoals hoornvlies brandwonden worden vaak gebruikt, maar onlangs is gebleken dat minder betrouwbaar dan dieper bezienswaardigheden zoals de spieren van de musculus rectus, de choroideus horizontalis of de s-opsin verloop. Hier, bieden wij een uitvoerige gids voor het gebruik van diep oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden nauwkeurig ontleden en vastleggen van de ruimtelijke oriëntatie van een geïsoleerde muis netvlies. Wij hebben ook in vergelijking van de effectiviteit van twee s-opsin antilichamen en een protocol voor s-opsin immunohistochemistry opgenomen. Omdat de richting van het netvlies volgens het verloop van de s-opsin retinale wederopbouw met Retistruct software en rotatie met aangepaste code vereist zijn, hebben we de belangrijke stappen vereist voor het gebruik van beide programma’s gepresenteerd. Globaal, is het doel van dit protocol is het leveren van een betrouwbare en herhaalbare set methoden voor nauwkeurige retinale oriëntatie die is aangepast aan de meest experimentele protocollen. Een overkoepelend doel van dit werk is op de standaardisering van de retinale oriëntatie methoden voor toekomstige studies.

Introduction

Een belangrijk en soms onderbelicht aspect van retinale neurowetenschappen is de goede richting en de analyse van het geïsoleerde geheel-mount netvlies, of het nu de richting van een netvlies in een electrofysiologie opname kamer of op een histologische dia. Dit is vooral belangrijk voor studies waarbij het netvlies van de muis, die momenteel het meest gebruikte model voor onderzoek van de zoogdieren visuele systeem. Recente ontdekkingen laten zien dat het netvlies muis geen ruimtelijk uniforme is maar dichtheid en grootte gradiënten van functioneel-verschillende retinale celtypen, zoals melanopsin peesknoopcellen, voorbijgaande OFF-alpha peesknoopcellen en kegel opsins1,2 heeft ,3,4,5. Bijgevolg, de gebruikte methode voor het bepalen van de richting van het netvlies van invloed kan zijn op de experimentele resultaten met betrekking tot cel type of opsin distributies2,3,6, richting afstemming van richting-selectieve ganglion cellen7,8,9, en topografische patronen van Retina degeneratie10,11,12,13,14 . In feite niet rapporteren hoe retinale oriëntatie is gemeld kan leiden tot verschillen in de literatuur en de verwarring wanneer u probeert om gegevens tussen studies te vergelijken. Daarom is het essentieel dat onderzoekers de methode melden voor de identificatie van de oriëntatie van het netvlies, zodat de resultaten van dergelijke onderzoeken nauwkeurig kunnen worden geïnterpreteerd.

Netvlies oriëntatie wordt vaak aangeduid met scoren het dorsale, ventrale, nasale of tijdelijke hoornvlies vóór oogbeschadigingen en/of enucleation1,3,12,15,16,17 19 18, ,of door snijden of kleuring diep anatomisch oog monumenten zoals de extraocular spieren6,7, het vaatvlies horizontalis20,21, of de s-opsin kleurovergang2,3. De spieren van de musculus rectus kunnen worden gebruikt voor identificatie de dorsale, ventrale, nasale en temporele netvlies door een diep verlichten verlaging inhouden die snijdt hoofdbundel van de bijlage van het of de superieure rectus, inferieur rectus, mediale rectus of laterale rectus spier, respectievelijk. Voor de meeste experimenten is met behulp van één Musculus rectus echter voldoende kunt u het netvlies22. De choroideus horizontalis, oftewel een overblijfsel van de ontwikkeling van het oog, kan worden beschouwd als een vage horizontale lijn op de achterkant van het oog. Elk einde van deze lijn eindigt in de neus of de temporele pool van de wereld-23. Tot slot, s-opsin expressie wordt asymmetrisch verdeeld aan de ventrale netvlies in muizen, en s-opsin antilichamen te onthullen het ventrale netvlies in immunohistochemische experimenten1kunnen worden gebruikt.

Recent werk van Stabio, et al.. 22 aangetoond dat oppervlakkige oogbeschadigingen en/of bezienswaardigheden zoals hoornvlies brandwonden een minder betrouwbare methode zijn kunt u het netvlies in anatomische ruimte, meest waarschijnlijk te wijten aan menselijke fouten en variabiliteit in het maken van het hoornvlies branden bij het gebruik van de temporele en mediale canthi als referentiepunten. Daarentegen is diepe oriëntatiepunten, zoals de musculus rectus superior, choroideus horizontalis en het verloop van de s-opsin, gebleken te zijn meer betrouwbare en nauwkeurige bezienswaardigheden kunt u het netvlies22. De identificatie van deze anatomische bezienswaardigheden vereist echter unieke dissectie stappen die niet in detail in de literatuur beschreven zijn. Het doel van dit protocol is dus om een uitgebreide tutorial over het gebruik van de musculus rectus superior, choroideus horizontalis en s-opsin verloop nauwkeurig identificeren de ruimtelijke oriëntatie van het netvlies van de muis. Daarnaast hebben we een vergelijking van de doeltreffendheid van de twee s-opsin antilichamen, evenals een protocol voor s-opsin immunohistochemistry opgenomen.

Een extra uitdaging aan studies te vertrouwen op precieze retinale oriëntatie is de grote verlichten bezuinigingen nodig om plat wholemount netvlies op een opname kamer, een schotel, of een dia. Dit kan leiden tot uitdagingen voor de analyse van wat natuurlijk een driedimensionale structuur is wanneer het image is gemaakt als een platte tweedimensionale structuur. Een programma genaamd Retistruct24 kan worden gebruikt op een vlakke wholemount netvlies terugkomen met de driedimensionale structuur, voordat de gegevens verzameld uit het wordt geanalyseerd. Dus, een deel van dit protocol is gewijd aan het markeren van de stappen die nodig zijn voor het gebruik van de software van de Retistruct te reconstrueren s-opsin immunostained muis netvlies. We hebben ook een sectie van protocol voor het gebruik van onze aangepaste MATLAB-script, dat werd ontwikkeld om nauwkeurig roteren en orient muis netvlies gekleurd met s-opsin opgenomen.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Akron. 1. het gebruik van de superieure Rectus spier Landmark te identificeren retinale oriëntatie Opmerking: De musculus rectus superior is een mijlpaal voor het dorsale netvlies (tabel 1). Als het experiment niet dat de markering van het dorsale netvlies vereist, slaat u stap 1 en verder met stap 2. Volg uw goedgekeurde institutionele Animal Care en gebruik Comité protocol voor muis euthanasie. Ter identificatie van de algemene oriëntatie van de wereld, maken een brandwond markeren op het dorsale hoornvlies rechtstreeks tussen de neus en tijdelijke canthi in de buurt van de grens van de hoornvlies-sclera onmiddellijk na euthanasie(Figuur 1). Maken het branden markeren door opwarmen met een brandijzer pen voor tien seconden en vervolgens het aanraken van het uiteinde van de pen om het dorsale hoornvlies voor minder dan een seconde.Opmerking: Bedrijf die de brandijzer pen om het hoornvlies voor lang leiden de hele wereld tot zal te doorprikken.Opmerking: Terwijl sommige pennen brandijzer licht uitzenden, de brandijzer pen vermeld in de Tabel van materialen doet niet elke licht uitstralen bij verhitting, waardoor het een veilige optie voor dark-adapted experimenten. Voor enucleation, kunt gebogen pincet voorzichtig uit een socket druk op het oog en grip van de hele wereld van onder. Niet knippen de oogzenuw te verwijderen van de hele wereld; in plaats daarvan langzaam lift de wereld uit het stopcontact terwijl tegelijkertijd verplaatsen zachtjes van links naar rechts totdat de hele wereld wordt vrijgegeven uit het stopcontact.Nota: Deze ontwerpresolutie zal het toestaan van de spieren van de musculus rectus blijven verbonden met de wereld als de hele wereld eindelijk volledig verwijderd uit het stopcontact. De oogzenuw blijft ook vaak gehecht aan de hele wereld. Overdracht van de hele wereld met de bijgevoegde rectus spieren in een petrischaal met dissectie medium. Zorg ervoor om bij te houden welke oog is het linker oog en het rechter oog.Opmerking: De dissector moet een passende dissectie-medium dat wordt uitgelijnd met hun experimentele protocol gebruiken. Zoek onder het toepassingsgebied van de dissectie, visueel het dorsale hoornvlies branden en identificeren van de musculus rectus superior met die er gekoppelde(Figuur 1). Met behulp van de dissectie schaar of een 20 G (0.9 mm x 25 mm) naald punctie (Zie Tabel of Materials), het hoornvlies op de branden merk. Maak een diepe knippen in de hele wereld naar de oogzenuw aan de superieure spier bisect verlichten. Een geïsoleerde en gereconstrueerde netvlies met deze verlaging wordt weergegeven in de figuren 1B en 1 C. Begin met het isoleren van het netvlies door door het gebruik van twee sets pincet (Zie Tabel van materialen) te zachtjes scheuren het gat gemaakt met de punctie in stap 1.6 totdat deel van het netvlies wordt blootgesteld.Opmerking: Het is belangrijk dat dit voorzichtig, als scheuren te krachtig worden gedaan kan de verlichten cut te scheuren verder. Pincet gebruiken om pesten elkaar het netvlies van de sclera totdat de sclera volledig is verwijderd. Verwijder de iris, lens, glasvocht en eventuele resterende structuren met pincet totdat het netvlies volledig geïsoleerd is.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Als het weefsel gaat vast te stellen voor s-opsin immunohistochemistry, ga verder met stap 3.5. 2. het gebruik van de Landmark choroideus horizontalis te identificeren retinale oriëntatie Opmerking: De choroideus horizontalis is aanwezig op de sclera op de achterkant van het oog, en loopt van de temporele pool naar de nasale pool (cijfers 2B en 2 C; Tabel 1). Volg goedgekeurde institutionele Animal Care en gebruik Comité protocol voor muis euthanasie. Ter identificatie van de algemene oriëntatie van de wereld, maken een brandwond markeren op het dorsale hoornvlies rechtstreeks tussen de neus en tijdelijke canthi in de buurt van de grens van de hoornvlies-sclera onmiddellijk na euthanasie(Figuur 2). Maken het branden markeren door opwarmen met een brandijzer pen voor tien seconden en vervolgens het aanraken van het uiteinde van de pen om het dorsale hoornvlies voor minder dan een seconde.Opmerking: Bedrijf die de brandijzer pen om het hoornvlies voor lang leiden de hele wereld tot zal te doorprikken. Enucleate van het oog af en breng de wereld in een petrischaal met dissectie medium. Zorg ervoor om bij te houden welke oog is het linker oog en het rechter oog.Opmerking: De dissector moet een passende dissectie-medium dat wordt uitgelijnd met hun experimentele protocol gebruiken. Visueel opsporen en identificeren van de choroideus horizontalis op de achterkant van het oog (Figuur 2B, 2 C).Opmerking: De choroideus horizontalis is ook zichtbaar binnen de oogschelp onder infrarood lichte20. Oriënteren de bol in de petrischaal zodat het dorsale branden gelegen aan de superieure paal is, aangezien het zijn zou als het oog nog steeds in de muis waren.Opmerking: De aanwezigheid van de dorsale branden maakt de identificatie van de nasale en temporele kant van de aardbol, zo lang als of er een oog rechts of links is gedocumenteerd: als er een rechter oog, de neus choroideus horizontalis zal worden rechts van de branden en de tempora l choroideus horizontalis zal worden aan de linkerkant van het branden. Als er een linker oog, de temporele choroideus horizontalis zal worden rechts van de branden en de nasale choroideus horizontalis zullen aan de linkerkant van het branden.Met behulp van de dissectie schaar of een 20 G (0,9 x 25 mm) naald (Zie Tabel of Materials), maken een lekke band in de wereld waar het dorsale branden zich bevindt. Maak een ondiepe verlichten gesneden richting de oogzenuw waar het dorsale hoornvlies branden zich bevindt. Deze verlaging zal worden loodrecht op de choroideus horizontalis, waardoor voor de identificatie van het dorsale netvlies na isolatie (Figuur 2D). Maken van de volgende twee diep verlichten sneden richting de oogzenuw: een door de voering van de bladen van de dissectie schaar omhoog met de temporele choroideus horizontalis lijn aan de achterkant van het oog, en een door de voering van de bladen van de dissectie schaar omhoog met de nasale vaatvlies horizontalis lijn op de achterkant van het oog. Deze verlagingen worden getoond op een afgelegen en gereconstrueerde netvlies in Figuur 2D en 2E.Opmerking: Als alternatief, een diepe snee kan worden gemaakt op de temporele choroideus horizontalis en een ondiepe snee kan worden gemaakt op de nasale choroideus horizontalis, het dorsale hoornvlies branden gesneden overbodig maken. Dit zorgt voor nauwkeurige oriëntatie van het netvlies met minder verlichten bezuinigingen. Begin met het isoleren van het netvlies door door het gebruik van twee sets pincet (Zie Tabel van materialen) te zachtjes scheuren het gat gemaakt met de punctie in stap 2.7 en 2.8 tot deel van het netvlies wordt blootgesteld.Opmerking: Het is belangrijk dat voorzichtig dit, als scheuren te krachtig kan leiden tot het verlichten cut(s) te breken verder. Pincet gebruiken om pesten elkaar het netvlies van de sclera totdat de sclera volledig is verwijderd. Verwijder de iris, lens, glasvocht en eventuele resterende structuren met pincet totdat het netvlies volledig geïsoleerd is.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Als het weefsel gaat vast te stellen voor s-opsin immunohistochemistry, ga verder met stap 3.5. 3. het labelen van de S-opsin verloop in het netvlies van de muis Opmerking: De s-opsin photopigment expressie wordt asymmetrisch verdeeld over de ventrale netvlies1, waardoor het een uitstekende marker voor de ventrale helft van het netvlies. Deze methode is alleen nuttig voor vaste en immunostained weefsel (tabel 1). De volgende stappen kunnen worden toegepast op het netvlies dat met behulp van een van de bovengenoemde methoden hebben is ontleed. Volg goedgekeurde institutionele Animal Care en gebruik Comité protocol voor muis euthanasie. Onmiddellijk na de euthanasie, enucleate van het oog en plaats van de hele wereld in een petrischaal met dissectie medium. Zorg ervoor om bij te houden welke oog is het linker oog en het rechteroog teneinde retinale oriëntatie nadat het netvlies is ontleed.Opmerking: De dissector moet een passende dissectie-medium dat wordt uitgelijnd met hun experimentele protocol gebruiken. Begin met het isoleren van het netvlies door door het gebruik van twee sets pincet (tabel of Materials) om een gat in het hoornvlies voorzichtig scheuren totdat deel van het netvlies wordt blootgesteld.Opmerking: Het is belangrijk dat dit voorzichtig, als scheuren te krachtig gebeuren kan het netvlies te scheuren. Pincet gebruiken om pesten elkaar het netvlies van de sclera totdat de sclera volledig is verwijderd. Verwijder de iris, lens, glasvocht en eventuele resterende structuren met pincet totdat het netvlies volledig geïsoleerd is.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Als met behulp van het netvlies voor een ex vivo experimenteren, doe het experiment voordat u de volgende stappen uitvoert. Met behulp van dissectie schaar, maken vier verlichten bezuinigingen in de retina zodat het zal plat liggen. Opstapelen het netvlies ganglion cel-kant op nitrocellulose membraan (Tabel van materialen) door zachtjes te drukken op elke hoek van het netvlies op het membraan met een tang.Opmerking: De locatie van de verlichten bezuinigingen kunnen willekeurige bij het gebruik van het s-opsin verloop voor retinale oriëntatie. Met behulp van Tang, overdracht het gemonteerde netvlies naar de eerste put in een 24-well plaat (Tabel van materialen) gevuld met 1 mL 4% paraformaldehyde (Tabel of Materials) voor fixatie. Plaats de 24-well-plaat op een roteerschudapparaat bij kamertemperatuur (Tabel van materialen) en monteren van het netvlies voor precies 40 min.Opmerking: Alle volgende incubatie en wassen stappen moet worden aangevuld met de 24-well-plaat op een roteerschudapparaat. Wassen het netvlies gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur door het over te dragen aan de tweede goed gevuld met 1 mL 0,1 M PBS. Herhaal deze stap tweemaal door achtereenvolgens het netvlies naar de 0,1 M PBS gevulde derde en vierde putten. De gemonteerde netvlies overbrengen in de vijfde goed met 1 mL van het blokkeren van de oplossing (1,7% Triton X-100 en 5,2% ezel normale serum in 0,1 M PBS; Zie Tabel van materialen) en na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Toevoegen van het konijn anti-s-opsin primair antilichaam (Zie Tabel van materialen) aan de blokkerende oplossing bij een concentratie van 1:500 en incubeer gedurende drie dagen bij 4 ° C. Wassen de overtollige primair antilichaam van het netvlies zes keer achter elkaar door deze te plaatsen in zes putten gevuld met 1 mL 0,1 M PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats van het netvlies in een goed met verse blokkerende oplossing (1,7% Triton X-100 en 5,2% ezel normale serum in 0,1 M PBS) en voeg ezel anti-konijn Alexa-594 secundair antilichaam (Zie Tabel van materialen). Incubeer het netvlies met het secundaire antilichaam ‘s nachts bij 4 ° C. Wassen de overtollige secundair antilichaam van het netvlies zes keer achter elkaar door deze te plaatsen in zes putten gevuld met 1 mL verse 0,1 M PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Met behulp van Tang, overbrengen in het gekoppelde netvlies een petrischaal met 0,1 M PBS. Ontgrendel het netvlies van het membraan van het nitrocellulose door zachtjes het invoegen van de uiteinden van het pincet tussen het netvlies en het membraan tot het netvlies is niet meer gekoppeld. Monteren van het netvlies op een microscoopglaasje van glas door zachtjes het porren met de pincet totdat het netvlies houdt aan het glas vast en het verwijderen van de dia uit de petrischaal. Betrekking hebben op het netvlies op de dia met Aquamount en bedek het met een dekglaasje #1.5 aan. Plaats van de dia in een dia lade (Zie Tabel van materialen) en laat het zitten voor een uur bij kamertemperatuur. De dia retourneren naar de koelkast en de winkel in een dia lade (Zie Tabel van materialen) bij 4 ° C wanneer niet in gebruik. Nadat de dia coverslipped voor 24 uur is, gebruiken nagellak te verzegelen van de zijkanten van de dia. ter voorkoming van uitdroging.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. 4. met behulp van gereconstrueerd netvlies Immunostained met S-opsin te identificeren retinale oriëntatie Visualiseren van de s-opsin gradiënt met een confocal microscoop of een epifluorescerende-Microscoop met een camera-bijlage (Zie Tabel van materialen) en beeld van het netvlies, zodat het gehele netvlies zichtbaar in een afbeelding (cijfers 1B, 2D, 3A, en is 3D). Dit kan worden gedaan door het netvlies in secties op lage vergroting beeldvormings- en dan het stiksel van de beelden samen. Geef de naam van het netvlies zodat zij geïdentificeerd worden. Bijvoorbeeld noemt het eerste netvlies worden gereconstrueerd “Retina1”. Download en installeer ImageJ op https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Maak een afzonderlijke map voor elk netvlies dat moet worden gereconstrueerd, maar laat de mappen leeg. Maak bijvoorbeeld een map met een adellijke titel “Retina1”. Alle bestanden die nodig zijn voor de wederopbouw van deze netvlies zal worden geplaatst in deze map in de opeenvolgende stappen.Opmerking: De enige bestanden die deze mappen moeten bevatten zijn de bestanden die moeten worden geanalyseerd door Retistruct. Alle bestanden dan degene hieronder maakt het netvlies kunnen worden geopend door de Retistruct-software. Open de afbeelding van het netvlies in ImageJ door het selecteren bestand → Open en kiest u “Retina1”. Zonder hierin wijzigingen aan het beeld, sla het op als “image.png” naar de map met de titel “Retina 1” door het selecteren van bestand → opslaan als → PNG.Opmerking: Het bestand moet de naam “image.png” om de software van de Retistruct te erkennen van het bestand als een netvlies voor wederopbouw. Gebruik het hulpmiddel lijn gesegmenteerde te schetsen van de randen van het netvlies. Door te klikken op twee aangrenzende plaatsen op de rand van het netvlies, zal de gesegmenteerde lijn-tool in wezen “connect the dots” tussen de twee aangrenzende plaatsen, het creëren van een overzicht. Herhaal totdat het gehele netvlies heeft uitgestippeld. Sla het netvlies overzicht als “outline.roi” naar de map met een adellijke titel “Retina1” door het selecteren van analyseren → Tools → ROI manager → toevoegen [t] → meer → opslaan.Opmerking: De rand van het netvlies kan worden geïdentificeerd waar de s-opsin kleuring overgangen op de achtergrond. Gebruik het hulpmiddel lijn gesegmenteerde volgens de instructies in stap 4.7 te schetsen van de grens van de optische schijf. Sla de omtrek van de optische schijf als “od.roi” naar de map met een adellijke titel “Retina1” door het selecteren van analyseren → Tools → ROI manager → toevoegen [t] → meer → opslaan.Opmerking: De optische schijf is aangemerkt als het kleine gat in het midden van het netvlies, en zullen variëren, afhankelijk van de kwaliteit van de dissectie.Opmerking: Alle bestanden die nodig zijn voor de wederopbouw van de Retistruct (“image.png”, “outline.roi” en “od.roi”) moet nu worden opgeslagen de map “Retina1”. Om te downloaden, installeren, en open het programma Retistruct, volg de instructies in de gebruikershandleiding van de Retistruct gevonden in de sectie aanvullende materialen van Sterratt, et al. 24 Zodra de Retistruct venster is verschenen, klikt u op de “Open” pictogram aan de top links van het venster en selecteer de map “Retina1”. Een afbeeldingsvenster zal opduiken die aangeeft dat er geen schaal bar bestaat. Klik op “Sluiten” en een afbeelding van het netvlies wordt weergegeven in het vak. Visualiseren van de omtrek van het netvlies door te klikken op de knop “Eigenschappen” in de top recht van venster en verandering kleur van de omtrek een zichtbare kleur (Figuur 5A). BELANGRIJK: Opgeven of het netvlies van een rechter oog of linker oog in het deelvenster aan de linkerkant (Figuur 5A). Klik op de knop “Toevoegen Tear” aan de linkerkant en geven waar een scheur of knip het netvlies door te klikken op de drie hoekpunten van de scheur (Figuur 5A). Hiermee maakt u lijnen de drie hoekpunten van het deelstuk uitmaakt tussen. Herhaal voor alle bezuinigingen in de retina. Geef het dorsale netvlies door te klikken op een willekeurig punt van het netvlies overzicht. Een hoofdletter “D” verschijnt op dat moment op de omtrek (Figuur 5B).Opmerking: Het dorsale netvlies worden de donkere helft van het netvlies, tegenover het s-opsin verloop. Markering op de dorsale retina in Retistruct is echter niet een betrouwbare methode voor het identificeren van de dorsale helft van het netvlies, zodat de markering van “dorsale” willekeurige in deze stap kan worden. Reconstrueren het netvlies door te klikken op de “Reconstrueren Retina” knop aan de bovenkant van het scherm (Figuur 5B verlaten). Een polar plot van het gereconstrueerde netvlies zal verschijnen met de bezuinigingen zichtbaar in dezelfde kleur als de omtrek (Figuur 5C). Klik op de “Opslaan” knop aan de rechterkant van het scherm zodat het gereconstrueerde netvlies en alle bijbehorende gegevens worden opgeslagen in de map map “Retina1” (Figuur 5D). Het gereconstrueerde netvlies opslaan door te klikken op de “PDF”-knop aan de rechterzijde (Figuur 5D). Een vak verschijnt wordt gevraagd voor de specificaties van de grootte. De standaardgrootte is aanvaardbaar voor de volgende stappen. Hierdoor bespaart de gereconstrueerde retina als “image.polar.pdf” in de map van de map “Retina1”. Open “image.polar.pdf” in een tekenprogramma (of andere beeldbewerkingsprogramma) en gebruik het “Emmertje” (of soortgelijke) te veranderen de achtergrond van het gereconstrueerde netvlies naar zwart. Het gereconstrueerde netvlies opslaan als een TIF-bestand, zoals “Retina1_reconstructed.tif” in de map van de map “Retina1”.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Download de MATLAB-code voor het draaien van het netvlies genaamd “Retina_Rotator.m” (Zie aanvullende materialen). Plaats het codebestand in een eigen map met geen andere bestanden in de map. Openen van MATLAB, versie 2007b of hoger. Dubbelklik op het codebestand te openen in MATLAB. Typ “Retina_Rotator” in het opdrachtvenster en vervolgens treffer naar de steken toonsoort. Er verschijnt een zoekvenster.Opmerking: De code is specifiek voor .tif-bestanden. Als het bestand moet worden gedraaid niet de juiste indeling is, zal de code het netvlies correct en niet draaien. Zie de stappen 4.17 en 4.18. voor het opslaan van het gereconstrueerde netvlies in de juiste indeling. Open het bestand moet worden gedraaid. Bijvoorbeeld, kies “Retina1_reconstructed.tif”. De code zal vervolgens het gereconstrueerde netvlies analyseren en zal automatisch het gedraaide netvlies opslaan als “Retina1_reconstructed_rotated.tif” in de map waarin het oorspronkelijke bestand zich bevindt. Nadat de code klaar is met het analyseren van het netvlies, verschijnt een venster ook tonen van de beelden van het netvlies, voor en na rotatie voor vergelijking (cijfers 3B en 3 C; Cijfers 3E en 3F).Opmerking: Deze code wordt het gereconstrueerde netvlies gedraaid zodat de ventrale (helderste) helft op de bodem is en de dorsale (schemerigste) helft op de top is, dus nauwkeurig kunt u het netvlies volgens de s-opsin kleurovergang1. Als het netvlies van een rechter oog is of linker oog heeft aangetoond, kan het zijn dat de locatie van de nasale en temporele Polen ook worden geëxtrapoleerd uit deze methode van oriëntatie (Figuur 3).

Representative Results

Een enkele verlichten verlaging inhouden die snijdt hoofdbundel van de musculus rectus superior, nauwkeurig en betrouwbaar identificeert het dorsale netvlies (Figuur 1). De choroideus horizontalis identificeert nauwkeurig en betrouwbaar het nasale en temporele netvlies met diepe verlichten bezuinigingen langs de temporele en nasale choroideus horizontalis (Figuur 2). In dit voorbeeld een verlichten knippen ook geboekt in de dorsale retina teneinde de dorsale/ventrale as van het netvlies (Figuur 2D, verticale pijl). De stappen van deze processen staan ten behoeve van replicatie door toekomstige dissectors. Een combinatie van s-opsin immunohistochemistry (figuur 3A en 3D), wederopbouw met Retistruct software (3B, 3E) en nauwkeurige vruchtwisseling met een aangepaste code voor MATLAB (3 C, 3F) voorziet in de identificatie van de ventrale en dorsale helften van het netvlies, evenals de nasale en temporele Polen als het is bekend of het netvlies van een oog van rechts of links (Figuur 3). Wij ook ten opzichte van twee veelgebruikte s-opsin primaire antilichamen voor effectiviteit in het labelen van s-opsin kegels (Figuur 4A-D): zowel de geit anti-s-opsin primair antilichaam en het konijn anti-s-opsin primair antilichaam effectief label s-opsin kegels (Figuur 4E) in de dezelfde muis. Verlichten bezuinigingen op s-opsin immunostained gereconstrueerd netvlies werden geïdentificeerd en hun locaties werden vergeleken met de afdrukstand bepaald door de s-opsin verloop. Met behulp van onze aangepaste MATLAB code (Zie Aanvullende materialen), netvlies nauwkeurig werden gedraaid zodat de hoogste concentratie van s-opsin kleuring ventrally ligt, waardoor echte dorsale op 90 ° (voor superieure rectus), waar nasaal bij 0 ° (voor nasaal choroideus horizontalis) en ware temporele op 180 ° (voor tijdelijke choroideus horizontalis). De waarde van elk individu verlichten gesneden hoek werd bepaald met behulp van het hulpprogramma hoek in ImageJ nadat netvlies werden gedraaid volgens het verloop van de s-opsin. Een gemiddelde hoek werd berekend voor elk verlichten type knippen en de gemiddelde waarde van elk verlichten gesneden type werd vervolgens uitgezet op een polar perceel (Figuur 6). Gemiddeld, superieure rectus spier bezuinigingen de dorsale paal bij 96.3 ± 4,3 ° geïdentificeerd (n = 11) (Figuur 6). De nasale choroideus horizontalis geïdentificeerd de nasale paal op 6,7 ± 5,8 ° en de temporele choroideus horizontalis geïdentificeerd de temporele paal bij 172.0 ± 4.4° (n = 9; Figuur 6). Figuur 1: de musculus rectus superior met nauwkeurig identificeren het dorsale netvlies van een rechteroog. (A) een voorbeeld van een dorsale hoornvlies branden in de buurt van de cornea-scleral grens gemaakt met een brandijzer tip pen (witte pijl). De musculus rectus superior is ook zichtbaar in deze weergave (witte pijl). (B) een voorbeeld van een geheel gemonteerd netvlies met een verlichten van gesneden in de dorsale retina gemaakt door het bisecting van de musculus rectus superior. Pijl toont de diepe knippen in het dorsale netvlies gemaakt door de bisecting van de musculus rectus superior verlichten. Het netvlies is gekleurd met primair antilichaam geit anti-s-opsin (Zie Tabel van materialen) en secundair antilichaam ezel anti-geit Alexa 594 (Zie Tabel of Materials; excitatie: 590 nm, emissie: 620 nm) (cyaan). Netvlies was beeld met een Microscoop epifluorescerende met een Texas rood filter (595 nm). (C) A netvlies gereconstrueerd in Retistruct en gedraaid met een aangepaste code van MATLAB (Zie Aanvullende materialen) met de superieure rectus spier verlichten gesneden zichtbaar (witte pijl). D: dorsal, V: ventrale, T: stoffelijk, N: nasaal. Schaal bars = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: met behulp van de choroideus horizontalis nauwkeurig identificeren de nasale en temporele Polen van het netvlies van een rechteroog. (A) een voorbeeld van een dorsale hoornvlies branden in de buurt van de cornea-scleral grens gemaakt met een brandijzer tip pen. (B) het vaatvlies horizontalis zichtbaar op de achterkant van het oog op de sclera (witte pijl). Het dorsale hoornvlies branden is ook zichtbaar in deze weergave, gelegen ongeveer 90° van de temporele choroideus horizontalis. (C) het vaatvlies horizontalis zichtbaar op de achterkant van het oog op de sclera, reizen van de oogzenuw naar de cornea-scleral grens. (D) een netvlies gekleurd met geit anti-s-opsin (Zie Tabel van materialen) en secundair antilichaam ezel anti-geit Alexa 594 (Zie Tabel of Materials; excitatie: 590 nm, emissie: 620 nm) (cyaan) met choroideus horizontalis bezuinigingen (horizontaal pijlen) en de dorsale verlichten knippen (verticale pijl). Netvlies was beeld met een Microscoop epifluorescerende met een Texas rood filter (595 nm). (E) een netvlies gereconstrueerd in Retistruct en met een aangepaste code voor MATLAB (Zie aanvullende materialen) gedraaid met de dorsale verlichten gesneden en de nasale en temporele choroideus horizontalis bezuinigingen zichtbaar (witte pijlen). D: dorsal, V: ventrale, T: stoffelijk, N: nasaal. Schaal bars = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: met behulp van het s-opsin verloop te identificeren alle vier stokken van het netvlies. (A) een voorbeeld van een netvlies ontleed van een rechter oog, dat is immunostained aan het label s-opsin en beeld met een Microscoop epifluorescerende met een Texas rood filter (595 nm). De bezuinigingen in deze netvlies zijn willekeurige aangezien de topografische oriëntatie wordt bepaald door de s-opsin verloop. (B) de resultaten op de wederopbouw van het netvlies in A met Retistruct. Merk op dat de s-opsin gradiënt is niet correct uitgelijnd omdat het netvlies is niet uitgevoerd door de aangepaste code voor MATLAB (Zie Aanvullende materialen). (C) de resultaten van het draaien van het netvlies in A met de aangepaste code. Het netvlies is gedraaid zodat de hoogste concentratie van s-opsin kleuring gelegen aan de onderkant is en de ventrale Retina genoemd. Omdat het netvlies afkomstig van een rechter oog is, de temporele paal is gelegen 90° tegen de klok in vanaf de dorsale pole en de nasale paal is gelegen 90° met de klok mee vanaf de dorsale pole. (D) een voorbeeld van een netvlies ontleed uit een linker oog, dat is immunostained aan het label s-opsin en beeld met een Texas rood filter (595 nm). De bezuinigingen in deze netvlies zijn willekeurige aangezien de topografische oriëntatie wordt bepaald door de s-opsin verloop. (E) de resultaten van digitaal reconstructie van het netvlies in D met Retistruct. Merk op dat de s-opsin gradiënt is niet correct uitgelijnd omdat het netvlies is niet gedraaid door de aangepaste code. (F) de resultaten van het draaien van het netvlies in D met de aangepaste code. Het netvlies is gedraaid zodat de hoogste concentratie van s-opsin kleuring gelegen aan de onderkant is en de ventrale Retina genoemd. Omdat het netvlies afkomstig van een linker oog is, de neus paal is gelegen 90° tegen de klok in vanaf de dorsale pole en de temporele paal is gelegen 90° met de klok mee vanaf de dorsale pole. D: dorsal, V: ventrale, T: stoffelijk, N: nasaal. Schaal bars = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: vergelijking van twee primaire s-opsin antilichamen in labeling s-opsin kegels. (A) A netvlies gekleurd met de geit anti-s-opsin primair antilichaam (Zie Tabel van materialen). (B) de andere retina van de dezelfde muis gekleurd met konijn anti-s-opsin primair antilichaam (Zie Tabel van materialen). (C) A vertegenwoordiger regio (0.1 x 0,1 mm2) van een netvlies gekleurd met de geit anti-s-opsin primair antilichaam. Foto genomen op een epifluorescerende Microscoop op 40 X vergroting. (D) een vertegenwoordiger regio (0.1 x 0,1 mm2) van een netvlies gekleurd met konijn anti-s-opsin (Zie Tabel of Materials), een primair antilichaam alternatief. Beeld is genomen op een epifluorescerende Microscoop op 40 X vergroting. (E) beide antilichamen label hetzelfde aantal s-cone buitenste segmenten want er is geen significant verschil in het aantal immunopositive s-kegels die zijn gekleurd door geit anti-s-opsin en konijn anti-s-opsin op elk van de geteste retinale excentriciteiten (n = 2; ANOVA met post hoc Bonferroni test; p > 0,05). Schaal bars = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: een visuele gids voor het gebruik van de software van de Retistruct te reconstrueren netvlies immunostained met s-opsin. (A) A netvlies geopend in Retistruct met de zichtbare omtrek en een “Tear” toegevoegd. Punten van de “scheur” worden aangeduid met bovenliggende witte pijlen. Alle bezuinigingen in deze netvlies zijn willekeurig, geen bijzondere mijlpaal werd gebruikt voor het markeren van retinale oriëntatie tijdens dissectie. Belangrijke knoppen worden beschreven in het rood. (B) een netvlies met alle “Tears” toegevoegd en het dorsale netvlies geïdentificeerd met “D” op de rand van het netvlies. Merk op dat de “Reconstrueren Retina”-knop nu zichtbaar is. Belangrijke knoppen worden beschreven in het rood. (C) het proces van wederopbouw van een netvlies. De polar plot van het gereconstrueerde netvlies zal verschijnen aan de rechterkant, tonen dat de verlichten snijdt in cyaan (blauwe pijlen bovenop om te verduidelijken gesneden locaties). (D) het eindresultaat van het runnen van een netvlies via Retistruct. Het oorspronkelijke wholemount netvlies blijft aan de linkerkant en het gereconstrueerde netvlies aan de rechterkant wordt weergegeven. De verlichten bezuinigingen zijn zichtbaar in cyaan (witte pijlen bovenop om te verduidelijken gesneden locaties). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6: de superieure rectus spier- en vaatvlies horizontalis kan worden gebruikt om te nauwkeurig te oriënteren de muis netvlies. Een polar plot van de hoeken verkregen van beide superieure rectus spier verlichten van bezuinigingen of choroideus horizontalis snijdt in het netvlies die zijn gerenoveerd met Retistruct. Verlichten bezuinigingen op s-opsin immunostained gereconstrueerd netvlies werden geïdentificeerd en hun locaties werden vergeleken met de locatie van het s-opsin verloop. Met behulp van de douanecode van MATLAB nauwkeurig het netvlies draaien zodat de hoogste concentratie van s-opsin kleuring is gelegen ventrally, echte dorsale (90° voor superieure rectus), waar nasaal (0° voor nasale choroideus horizontalis) en temporele (180° voor tijdelijke vaatvlies waar horizontalis) werden bepaald voor elke netvlies. De waarde van elke afzonderlijke verlichten van gesneden hoek werd bepaald in ImageJ en een gemiddelde hoek werd berekend voor elk verlichten gesneden type. Superieure rectus spier bezuinigingen geïdentificeerd de dorsale paal bij 96.3 ± 4,3 ° (n = 11). De nasale choroideus horizontalis geïdentificeerd de nasale paal op 6,7 ± 5,8 ° en de temporele choroideus horizontalis geïdentificeerd de temporele paal bij 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Diepe Landmark Hoornvlies Burn locatie Pool van Retina geïdentificeerd Experimentele toepassing Superieure Rectus Dorsale Dorsale Live of vaste Nasale choroideus horizontalis Dorsale Nasaal Live of vaste Temporele choroideus horizontalis Dorsale Temporele Live of vaste S-opsin verloop Geen Dorsal ventrale, nasale, temporele Vaste Tabel 1: Diepe monumenten, de pool van het netvlies zij identificeren, en of ze kunnen worden gebruikt voor verzending van live of vaste weefsel toepassing.

Discussion

Er is geen omvattende, gestandaardiseerde protocol voor het bepalen en het labelen van de oriëntatie van het netvlies van de geïsoleerde muis in anatomische ruimte. Het protocol gedetailleerde hier pogingen om deze leemte opvullen door te standaardiseren en detaillering van het gebruik van diep anatomische bezienswaardigheden zoals referentiepunten aan betrouwbaar identificeren retinale oriëntatie. Het is aangetoond dat de diep anatomische bezienswaardigheden in dit protocol een meer accurate en betrouwbare methode bieden kunt u het netvlies van de muis dan oppervlakkige bezienswaardigheden zoals hoornvlies brandwonden22. Dus, kunnen op studies die hebben vertrouwd op hoornvlies brandwonden voor retinale oriëntatie meer fouten in oriëntatie dan studies die hebben vertrouwd op bezienswaardigheden zoals de spieren van de musculus rectus en choroideus horizontalis hebben gehad. Deze discrepantie benadrukt de behoefte aan en de betekenis van dit gestandaardiseerde protocol met betrekking tot de interpretatie van resultaten en het maken van vergelijkingen tussen studies die afhangen van nauwkeurige retinale oriëntatie. Over het geheel genomen zorgt een gestandaardiseerde protocol voor een gemeenschappelijke methode voor visie onderzoekers te volgen, waardoor de aanwezigheid van een storende variabele in data-acquisitie die zich kan voordoen met het gebruik van niet-gestandaardiseerde methoden voor de identificatie van de retinale oriëntatie.

De hier gepresenteerde methoden zijn gemakkelijk herhaalbaar en toepasbaar is in vele soorten experimentele protocollen. In feite, is een van de grootste voordelen van dit protocol zijn aanpassingsvermogen. Omdat de choroideus horizontalis, s-opsin expressie en rectus spier bezienswaardigheden allemaal retinale oriëntatie22 de mijlpaal die het best past bij de experimentele parameters kan worden gekozen gebleken zijn voor het optimaliseren van de data-acquisitie (tabel betrouwbaar te identificeren 1). Daarnaast methoden van dissectie kunnen worden gecombineerd teneinde te verduidelijken op de oriëntatie van het netvlies. Bijvoorbeeld choroideus horizontalis bezuinigingen kunnen worden gecombineerd met s-opsin immunohistochemistry om te oriënteren alle vier stokken van het netvlies: nasale en temporele hemisferen kunnen worden geïdentificeerd door de choroideus horizontalis bezuinigingen, en s-opsin immunohistochemistry kan identificeren ventrale en dorsale hemisferen. Nog, het aanpassingsvermogen van dit protocol kan worden beperkt door de tijd-gevoelige aard van fysiologie experimenten. Omdat de tijd die nodig is om te identificeren een mijlpaal, een hoornvlies brandwond maken en uitvoeren van een verlichten knippen in aanzienlijke weefsel dood in ex vivo experimenten resulteren kan, is het mogelijk dat sommige van deze methoden dissectie minder dan optimaal. Gelukkig, zodra een dissector vertrouwd te met de choroideus horizontalis of superieure rectus spier dissectie methode, raken heeft identificatie van de diepe bezienswaardigheden en het maken van het verlichten van de bezuinigingen snel een deel van de dissectie routine geworden en geen aanzienlijk toevoegt aan de lengte van de dissectie. Hoewel we erkennen dat de hier gedetailleerde stappen op tijd aan zeer tijd-gevoelige experimenten toevoegen kunnen, raden we u aan het verloop van de s-opsin voor post hoc retinale oriëntatie wanneer de levensvatbaarheid van het weefsel niet langer een probleem (Figuur 3 is ). Kleuring van het netvlies, voor s-opsin een effectieve manier om zich te oriënteren op het netvlies, is zoals het alle vier Polen identificeren kan: s-opsin kleuring verdeelt het netvlies in dorsale en ventrale Polen en maakt het mogelijk voor de identificatie van de nasale en temporele palen naargelang het netvlies is van een oog van rechts of links (Figuur 3). Daarom vinden wij dat dit protocol biedt een betrouwbare en herhaalbare set methoden voor nauwkeurige retinale oriëntatie die kan voldoen aan eventuele experimentele parameters.

Als met een gewijzigde retinale dissectie, wordt de geldigheid van de dissectie-methode beperkt door de nauwkeurigheid van de dissector en de kwaliteit van het weefsel dat geïsoleerd is. Als een weefsel verloren tijdens dissectie is of een netvlies is te vervormd voor nauwkeurige wederopbouw, zal Retistruct en de MATLAB-programma niet zitten kundig betrouwbaar reconstrueren of oriënteren op het netvlies. Daarom is het belangrijk naar de praktijk van de dissectie-methode voor te gebruiken voor het verzamelen van gegevens experimenten. Terwijl de soorten dissecties uitgelegd hier zijn niet moeilijk, moeten ze worden beoefend om ervoor te zorgen de herhaalbaarheid van de identificatie van de retinale oriëntatie met een bijzondere mijlpaal. Bovendien is het essentieel dat de praktijk van de dissector visueel identificeren de anatomische bezienswaardigheden voorafgaand aan begin van gegevensverzameling om zorg ervoor dat de juiste landmark wordt gebruikt. Unidirectioneel om te controleren van de juistheid van een bepaalde dissector is om beide choroideus horizontalis snijdt of Musculus rectus superior snijdt en vergelijk de locatie van de bezuinigingen op het verloop van de s-opsin, omdat het een vaste markering en dus niet afhankelijk van de nauwkeurigheid van dissectio is n. potentiële dissectors kunnen ook vergelijken hun gereconstrueerde netvlies naar de voorbeelden van gereconstrueerde netvlies met nauwkeurige landmark bezuinigingen zijn afgebeeld in Figuur 1 pt Figuur 2. In wezen, een potentiële dissector moet worden uitgevoerd door de stappen in dit protocol voor een bepaalde dissectie-type, of het nu de musculus rectus superior of vaatvlies horizontalis methode, en vergelijken de resultaten op het verloop van de s-opsin om de geldigheid van een bijzondere dissector. Omdat als de dissector is niet zeker over de locatie van de bezienswaardigheid, kan dit resulteren in een onjuiste stand van het netvlies dat zal, standaard, invloed op gegevensverzameling en interpretatie.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zouden graag bedanken Bretagne dag en Jessica Onyak voor hun technische bijstand en Dr. Liu voor kandidatuur laten gebruiken zijn epifluorescerende Microscoop. Met dank aan steun: NIH R15EY026255-01 en de Karl Kirchgessner Stichting.

Materials

0.1 M Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich  P5244
Axioplan2 Epifluorescent Microscope Zeiss N/A
Clear Nailpolish N/A N/A
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker Sigma-Aldrich CLS6780FP
Costar TC-Treated 24-well Plates Sigma-Aldrich CLS3524
Dissection Microscope Olympus SZ51
Donkey anti-Goat Alexa 594 Life Technologies  A11058
Donkey anti-Rabbit Alexa 594 Life Technologies  A21207
Donkey Normal Serum Millipore 566460 Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Goat anti-s-opsin Santa Cruz Biotechnologies  sc-14363 Not commerically available as of 2017
Graefe Curved Forceps Fine Science Tools 11052-10
ImageJ or FIJI National Institute of Health N/A Freely available software
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer Bovie Medical Corporation AA00
MATLAB MathWorks N/A At least version 2007b or later
Micro Cover Glasses  VWR International 48393-241
Micro Slide Trays VWR International 82020-913
Moira Ultra Fine Forceps Fine Science Tools  11370-40
Nitrocellulose membrane Millipore HAWP04700
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714-S Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)
PrecisionGlide Needle 20G (0.90mm x 25mm)  BD PrecisionGlide 305175
Pyrex Glass Petri Dish Sigma-Aldrich CLS3160152
R The R Project for Statistical Computing N/A Freely available software; version 3.4.3 or later
Rabbit anti-s-opsin Millipore ABN1660
Retiga R3 Microscope Camera Qimaging 01-RET-R3-R-CLR-14-C
Retistruct N/A N/A Freely available software  compatiable with Windows 7 or Windows 10
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media Fisher Scientific 14-390-5
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)
Vannas Spring Dissection Scissors  Fine Science Tools 15000-03
5MP USB Microscope Digital Camera AmScope MU500 To be used with the Olympus Dissection Microscope
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
  2. Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina. Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).
  3. Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina. J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).
  4. Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).
  5. Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina. Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).
  6. Valiente-Soriano, F. J., et al. Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina. Front Neuroanat. 8, 131 (2014).
  7. Sabbah, S., et al. A retinal code for motion along the gravitational and body axes. Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).
  8. Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function. Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).
  9. Huberman, A. D., et al. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).
  10. Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia. eNeuro. 3 (5), (2016).
  11. Maiorano, N. A., Hindges, R. Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map. Nat Commun. 4, 1938 (2013).
  12. Hadj-Said, W., et al. Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).
  13. Tao, Y., et al. The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina. Sci Rep. 5, 18612 (2015).
  14. Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).
  15. Estevez, M. E., et al. Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision. J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).
  16. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses. J Vis Exp. (61), (2012).
  17. Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts. Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).
  18. Ortin-Martinez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  19. Zhang, H., et al. The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice. J Ophthalmol. 2017, 9721362 (2017).
  20. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
  21. Wang, J., et al. Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
  22. Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. J Comp Neurol. 526 (11), (2018).
  23. Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup. Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).
  24. Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package. PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).

Tags

Mouse RetinaOcular LandmarksDissection ProtocolSpatial OrientationRetinal TopographyDorsalVentralNasalTemporalCorneal BurnRectus MusclesChoroid FissureS-opsin GradientEnucleationRetinal IsolationSclera RemovalIrisLensVitreousRight EyeLeft Eye

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Sondereker, K. B., Stabio, M. E., Jamil, J. R., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks. J. Vis. Exp. (138), e57861, doi:10.3791/57861 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image