斑马鱼胰岛单细胞分辨率钙成像对β细胞功能的分析

所有的程序, 包括动物被批准的动物福利法案, 并征得 Landesdirektion Sachsen, 德国 (亚利桑那州 24–9168.11-1/2013-14, T12/2016) 的许可。 1. 准备 注: 本协议是对斑马鱼原胰岛从双转基因 Tg (Renilla-mKO2; cryaa: CFP) 的体外成像;Tg (ins: GCaMP6s; cryaa: mCherry) 19 斑马鱼。在这一转基因线, 胰岛素启动子 (ins) 驱动β细胞特异表达两个转基因: nls-Renilla-mKO2, 这标志着β细胞细胞核与单体 Kusabira 橙 2 (mKO2) 荧光;和 GCaMP6s15, 它发出绿色荧光反应增加细胞内钙水平。GCaMP6s 的β细胞特异表达能够研究β细胞的葡萄糖反应性, 而不受周围细胞类型钙变化的干扰。 在2毫升离心管中, 将10毫克的牛纤维蛋白原溶于1毫升的钙2 +/毫克1.5 +含汉克斯的平衡盐溶液 (HBSS), 制备新鲜纤维蛋白原 (10 毫克/毫升)。漩涡大力, 直到纤维蛋白原粉完全溶解。使溶液在室温下保持至少15分钟。注: 如果溶液开始聚合并变得粘稠, 可以在室温下保存2–3。 通过稀释 HBSS 中的纤维蛋白原三倍, 制备纤维蛋白原工作溶液 (3.3 毫克/毫升)。例如, 将300µL 的纤维蛋白原储存在600µL 的 HBSS 中, 准备900µL 的纤维蛋白原工作溶液。 在1毫升的 HBSS 或磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中溶解10单位凝血酶, 制备凝血酶溶液 (10 U/毫升)。注: 本解决方案可提前准备, aliquoted 50 µL 部分, 冷冻-20 摄氏度。 在50毫升水中溶解1.8 克 d-葡萄糖, 制备200毫米 d-葡萄糖溶液。保持4摄氏度, 长期贮存。 在50毫升水中溶解1.1 克氯化钾, 制备300毫米氯化钾溶液。保持4摄氏度, 长期贮存。 采购35毫米直径的玻璃底部的菜肴, 以安装胰岛。 对于胰岛的解剖和安装, 使用装有荧光灯和红色过滤器立方体的立体声显微镜 (TRITC: 励磁: 532–554 nm, 发射: 570–613 nm; 或得克萨斯红色: 励磁: 540–580 nm, 发射: 592–667 nm)。 为了成像β细胞中的钙流入, 使用一个倒置共焦显微镜 (蔡司 LSM 780 或类似) 与 20X (0.8 NA) 的空气目标, 并配备一个板持有人为35毫米直径的玻璃底菜。 为 euthanizing 斑马鱼 tricaine 甲烷磺酸 (MS222) 制备200毫克/升溶液。 为斑马鱼解剖采购了 90 mm 培养皿。 2. 斑马鱼主要胰岛解剖和安装 弄死在 MS222 中使用长时间孵化的鱼。为此, 用渔网轻轻地将鱼从鱼缸中取出, 在含有 MS222 溶液的培养皿中孵化, 直到动物不显示鳃盖 (鳃) 运动;通常, 这需要5分钟. 将鱼转移到含有 HBSS 溶液的培养皿中, Ca2 +/毫克2 +。 在装有荧光灯和红色过滤器立方体的立体显微镜下, 解剖动物腹部右侧的皮肤, 以隔离胰腺。 为此, 用锋利的镊子将斑马鱼的皮肤从嘴里切开到肛门鳍上。剥去切开的皮肤露出腹部;这个截图暴露了内脏。采用 mKO2 在β细胞中的荧光表达, 通过显微镜下的目视检查确定胰岛的位置。如果需要, 取出肝脏的裂片, 因为它们可以覆盖胰岛, 使它很难找到。注意: 主胰岛位于腹部前部, 通常在右侧。 通过仔细去除周围组织如肝脏和脂肪细胞来清洁主胰岛。采取预防措施, 不要伤害或戳胰岛;在清除周围的组织后, 在胰岛表面的单个细胞变得明显。 将30µL 滴 HBSS 到玻璃底菜的中心。将解剖的胰岛转移到此下落。 用 HBSS 和一次用30µL 的纤维蛋白原工作溶液 (3.3 毫克/毫升) 仔细清洗胰岛。确保避免干燥的胰岛在洗涤步骤, 因为没有这样做导致细胞死亡。 慢慢地, 轻轻地加入10µL 的凝血酶溶液 (10 U/毫升)。离开胰岛和15–20分钟未触及的菜. 观察纤维蛋白原-凝血酶滴在此时会变得黏稠, 有点不透明。 3. GCaMP 荧光强度在斑马鱼主要胰岛的体外活体成像研究 在模具顶部添加200µL HBSS, 并将盘子小心地放在共焦显微镜的板架上。使用 20X, 0.8 NA, 空气目标为共焦成像。使用 brightfield 选项定位胰岛。 使用红色荧光过滤器查看β细胞中的核 mKO2 荧光, 重点放在胰岛上。单个原子核应该清晰可见。 通过手动改变共焦显微镜的焦平面来定位清晰的成像平面, 以便沿着其 z 轴沿胰岛的厚度移动。确保成像平面包含足够数量 (50–100) 的β细胞用于成像, 核 mKO2 荧光的亮度是均匀的, 特别是在胰岛中心。 使用 “智能设置” 菜单中的以下设置为 GCaMP6s 和 mKO2 荧光设置顺序获取: GCaMP6s, 激发: 488 毫微米, 发射: 500–555 nm, 假颜色: 绿色 (选择 “GFP”);mKO2, 励磁: 561 毫微米 (mCherry), 发射: 570–630 nm, 假颜色: 红色 (选择 “mCherry”)。注: 使用此设置, 红色通道将记录β细胞核的位置, 而绿色通道将记录 GCaMP 荧光强度。 在 “采集模式” 下, 将图像分辨率设置为 1024 x 1024 像素, 速度为 10, 平均为1。通过选择 “时间序列” 选项并设置500个周期的 “持续时间” 来启动连续录制, 每帧大约有2秒的捕获时间。注: 时间序列的前50帧对应于β细胞在5毫米葡萄糖浓度下的活动。这是基线响应。反应β细胞将显示在绿色荧光强度与时间的打蜡和减弱。我们观察到, 一些 (1–5%) 的β细胞振荡5毫米葡萄糖。 注意成像周期。在头50帧之后, 将周围溶液的葡萄糖浓度提高到10毫米而不停止记录。 在不扰动图像采集的情况下, 轻轻地将200毫米 d-葡萄糖溶液的5µL 放在保持胰岛的凝胶上。获得150帧在10毫米葡萄糖。注: 葡萄糖浓度的增加将增加在绿色通道中 GCaMP 荧光振荡的β细胞数量。 确保细胞细胞核在过程中保持稳定。如果胰岛在采集过程中有很广泛的震动, 原子核正从焦平面中移出, 则丢弃样本 (如果需要)。 等待足够的时间, 使纤维蛋白原-凝血酶模聚合, 以确保后续样品的稳定性。 在200帧, 进一步增加溶液浓度的20毫米, 轻轻吹打10µL 的200毫米 d-葡萄糖溶液。获得150帧的20毫米浓度。 350帧后, 去极化胰岛使用30毫米的氯化钾。为此, 添加20µL 的300毫米氯化钾库存解决方案。在这个阶段, 观察 GCaMP6s 荧光振荡将停止和固定在高强度;没有反应葡萄糖的β细胞也可能在氯化钾添加时显示绿色荧光强度的增加。 4. 单个β细胞 GCaMP 荧光迹的量化 注: 为了追踪和量化单个β细胞对不同葡萄糖水平的反应, 量化整个成像周期的 GCaMP 荧光强度。量化是在细胞分辨率下进行的。为此, 使用斐济20从图像中提取 GCaMP 荧光的强度值 (步骤 4.1–4.6), 电子表格软件或 R21执行分析 (步骤 4.8–4.9)。 使用 “LSM 工具箱” 在斐济打开图像文件。为此, 请选择 “插件 |LSM 工具箱 |显示 LSM 工具箱 “。在 “LSM 工具箱” 中, 单击 “打开 lsm” 并选择图像文件。注意: 对于 “LSM 工具箱” 不支持的格式, 首先将它们转换为 tiff 进行分析。 使用斐济的感兴趣区域 (ROI) 工具提取单元格的响应。在 “工具” 下的 “分析” 菜单中打开 “ROI 管理器”。使用位于工具栏中的 “多边形选择工具” 手动绘制 ROI。 在红色通道中绘制β细胞核可见的 ROI。选择 ROI, 使其覆盖大于细胞细胞核的区域, 以包括细胞的某些细胞质。确保在帧之间的 ROI 位置是一致的, 并在必要时调整位置。 单击 “添加 [t]” 按钮, 将选定的 ROIs 添加到 “ROI 管理器” 中。选择并向 ROI 中添加多个 ROIs 以获取多个单元格上的数据。 接下来, 从 “分析” 菜单中, 选择 “设置测量”。选择 “集成密度”, 用于指定区域内总荧光强度的提取。 转移到包含 GCaMP 荧光的绿色通道, 并在 “ROI 管理器” 中选择 “多指标”。注意: 这将为整个时间序列中的细胞提供强度测量。 如果由于胰岛的移动而需要调整 ROI 位置, 请手动编译不同帧中的强度测量。将这些值复制并粘贴到单独的电子表格中。 从 “LSM 工具箱” 获取图像帧的时间戳。使用 “套用邮票 |应用 t 邮票 |文件名 |转储到文本文件 “以获取时间戳。使用 “另存为” 选项保存时间戳, 或将它们复制到电子表格中。 在编译所有单元格的强度值时, 一次或自动执行一次单元格分析 (例如, 使用 Excel 公式或 R)。 在两个步骤中分析单个单元格。 在第一步中, 计算基线以上的荧光强度。为此, 计算基线荧光强度 (F0) 作为前50帧 (5 毫米葡萄糖) 的荧光强度的平均值。然后从整个时间序列 (f-f0) 减去基线 (f0)。注: 少数细胞可以在基底葡萄糖下显示清晰的 GCaMP 振荡, 通常在高浓度的刺激下继续。对于这样的细胞, 只有通过取细胞在荧光中的下降的初始帧的平均强度来估计 F0 。 在分析的第二步, 通过对荧光强度的规范化, 获得最终的 GCaMP 荧光强度。注意: 这是为了消除不同动物之间的小岛之间的差异。单个胰岛在葡萄糖刺激下显示不同水平的荧光发射。 将荧光强度除以最高强度值来正常化。为此, 计算峰值强度 (f最大-f0), 并按峰值强度除以基线减去值, 以产生最终的 GCaMP 荧光强度 (f-f0)/(f最大-f0)。 放弃在氯化钾刺激后没有表现出强度变化的细胞, 因为它们可能不健康或受损。 要在 r 中执行分析 (步骤 4.9–4.10), 请使用 r 脚本 (plotcelltrace。R) 提供本手稿。