التعامل مع الخلايا الحية لبناء الجمعية الخلوية 3D مستقرة دون سقالة اصطناعية

1-إعداد الخلايا الحفاظ على التحاليل الماوس الغدة الثديية الخلايا الظهارية (نمومج خلايا) مع 5 مل من د-الفنزويلية التي تحتوي على 10% (v) الجنين البقري (FBS) والمصل 1% (v) البنسلين-ستربتوميسين (P/S) في قارورة3 25 سم. إزالة دولبيكو تعديل المتوسطة النسر (د-الفنزويلية)، التي تحتوي على 10% FBS و 1% P/s. إضافة 3-5 مل من 37 درجة مئوية مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) (-) إلى قارورة. لاحظ أن الرقم الهيدروجيني لبرنامج تلفزيوني 7.1-7.3. إزالة كل برنامج تلفزيوني من قارورة استخدام المضخة. إضافة 1.5 مل التربسين 37 درجة مئوية (0.25%، w/v) قارورة. احتضان قارورة لمدة 1-2 دقيقة تقريبا عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO. إضافة 3.5 مل من د-الفنزويلية التي تحتوي على 10% FBS و 1% P/S إلى قارورة. ماصة المزيج. نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل والطرد المركزي أنه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أن نصف قطر دوران وسرعة دوران النابذة هي 16.6 سم و 1500 دورة في الدقيقة، على التوالي. تحت هذا الشرط، قوة الطرد المركزي النسبي 417 x ز. إضافة 5 مل MEM د جديدة (10% FBS و 1% P/S) بقارورة بعد يسفط المتوسطة (إذا كان ذلك مطلوباً، كريوبريسيرفي الخلايا مع الحل للواسمات، اتباع إرشادات الشركة المصنعة). 2-إعداد ديكستران (DEX) إعداد 80 ملغ/مل من محلول التنفيذ المباشر عن طريق خلط 10 مل من د-الفنزويلية (10% FBS، 1%P/S) و 0.8 غرام من التنفيذ المباشر. لاحظ أنه يمكن تصفية الحل التنفيذ المباشر مع عامل تصفية المحاقن (0.22 ميكرومتر) بعد أن يكون مثقف الخلايا لفترة كافية. إعداد تعليق خلية التي تحتوي على 40 مغ/مل متوسطة التنفيذ المباشر بخلط 200 ميليلتر من حل التنفيذ المباشر و 200 ميليلتر من تعليق خلية أعدت في 2.1. ملاحظة أن كثافة عدد من الخلايا في الحل هو حوالي 2.3 × 105 خلايا/مل. 3-الإعداد لليزر والفحص المجهري قم بتشغيل الليزر (موجه مستمرة، الطول الموجي نانومتر 1,064) (الشكل 1). لاحظ أن استخدام شعاع الليزر بطول موجه باللون الأحمر إلى المنطقة القريبة من الأشعة تحت الحمراء الأكثر فعالية؛ تسمى هذه المنطقة الطول الموجي نافذة التشخيصية والعلاجية10 حيث أنه يمتص الحد الأدنى من الخلايا. انقر نقراً مزدوجاً فوق الرمز البرامج. انقر نقراً مزدوجاً فوق رموز الكاميرا ①، أدى ② (الصمام)، تركيز ③ ضبط، و ④ مرحلة الانتقال. يقوم بعرض المقابلة ① ④ سوف تظهر (الشكل 1ب). 4-خلية التلاعب باستخدام “نظام تعويض اللون الليزر” 20 مكان ميكروليتر من عينة إعدادها في الخطوة 2، 2 على زجاج الغطاء السفلي (سمك 0.17 ملم، وحجم = 30 ملم × 40 ملم)، وتغطية ذلك مع زجاج الغطاء العلوي (سمك 0.17 ملم، وحجم = 18 ملم × 18 ملم)، مع فصل المقدمة من الفواصل اثنين (0.17 ملم سمك الحجم = 10 مم × 24 مم)، كما هو موضح في الشكل 2. علما أن هذه النظارات لا تتطلب طلاء خاص. وضع الخلية عينة إعدادها في الخطوة 4، 1 في عدسة الهدف أقل (الماء الغمر مع ca. 10 ميكروليتر، التكبير = 60 X، المسافة العمل = 0.28 ملم، الفتحة العددية = 1.2)). إرفاق عدسة الهدف الأعلى (الماء الغمر مع ca. 10 ميكروليتر، التكبير = 60 X، المسافة العمل = 2 مم، الفتحة العددية = 1.0) في الجزء العلوي من الخلية عينة. قم بتشغيل الصمام الخفيفة بواسطة النقر فوق رمز 2 (الشكل 1ب). ضبط المسافة بين العينة وعدسة الهدف أقل بواسطة النقر فوق الرموز الموجودة على لوحة 3 (الشكل 1ب) حتى يكون في التركيز. تشعيع أشعة الليزر في موقف 1 و 2 موقف (الشكل 1ب) العينة بواسطة النقر فوق الرموز الأول، والثاني، والثالث (الشكل 1ب). تعيين كثافة كل شعاع الليزر إلى 1500 ميغاواط عن طريق إدخال هذه القيمة في الرمز الرابع (الشكل 1ب). نقل المحاصرين مرحلة النموذج بواسطة النقر فوق رمز 4 التي تشير إلى اتجاهات (الشكل 1ب) حتى خلية في الموضع 1 (الشكل 1ب). اسحب المؤشر يشير إلى موقف 2 (الشكل 1ب) حتى آخر خلية المحاصرين في الموضع 2. 5-تشييد هيكل الخلية (3D) ثلاثي الأبعاد التلاعب خلية واحدة بحيث تكون على اتصال مع خلية أخرى. المحافظة على هذا الشرط ل 300 s; أي، يتعرض كل خلية لليزر ل 300 s. سجل س ص المحور هو مبين في الشكل 1ب. إنشاء تجميع خلية ثنائية الأبعاد تعسفي بمحاصرة ونقل خلية أخرى للخلايا. بناء جمعية خلوية 3D قبل الانتقال المرحلة صعودا وهبوطاً. وتؤكد أن الجمعية العامة لا تزال مستقرة بعد إيقاف تشغيل الليزر.