Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

Las células con frecuencia encuentran una acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS), producidas como subproductos de la respiración^1,2, proteína, lípido oxidación^3,4y procesos adicionales^{5, 6,7}. A pesar del papel beneficioso de ROS en diversos procesos biológicos como celular^8,9 y respuesta inmune¹⁰de señalización, un desequilibrio entre la producción de ROS y su desintoxicación puede ocurrir, lleva a oxidativo estrés⁷. Los objetivos biológicos de ROS son las proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, la oxidación de las cuales afectan su estructura y función. Por lo tanto, la acumulación de oxidantes celulares está fuertemente vinculada a una amplia gama de patologías como cáncer^9,11, inflamación^12,13y envejecimiento^{14, 15}y se han encontrado para ser implicado en la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson y ALS enfermedad^16,17,18.

Las proteínas recién sintetizadas y maduras son muy sensibles a la oxidación debido a las modificaciones potencialmente peligrosas de sus cadenas laterales, que forman la proteína estructura y función^19,20. Por lo tanto, el estrés oxidativo conduce generalmente a una inactivación de la proteína generalizada, mal plegamiento y agregación, llevando eventualmente a la muerte celular. Una de las estrategias celulares elegante para hacer frente a los daños potenciales de oxidación de proteínas es utilizar acompañantes redox-dependientes, que inhiben la agregación de proteína generalizada, en vez de formar complejos estables con las proteínas mal plegadas cliente^{21 ,22,23}. Estos acompañantes de primera línea de defensa se activan rápidamente por una oxidación específica (generalmente en residuos de cisteína) que se convierte en potente de la agregación de moléculas²⁴. Puesto que el estrés oxidativo resulta en la inhibición de la respiración y disminuye en los de niveles de ATP celular²⁵, canónicos acompañantes dependientes de ATP son menos eficaces durante el estrés oxidativo condiciones^{25,26 ,27}. Por lo tanto, acompañantes independientes de ATP redox-activa juegan un papel vital en mantener homeostasis de proteínas sobre la acumulación de oxidantes en bacterias y eucariotas (por ejemplo, Hsp33²⁸ y RidA²⁹ en bacterias, Get3³⁰ en la levadura, peroxirredoxinas³¹ en eucariotas). La actividad de estos acompañantes depende fuertemente reversibles estructurales cambios conformacionales inducidos por una oxidación específica que destapa hidrofóbicas regiones implicadas en el reconocimiento de las proteínas mal plegadas del cliente.

Investigación del mecanismo de la agregación y los principios que rigen el reconocimiento de las proteínas del cliente por acompañantes no es fácil debido a la naturaleza dinámica y heterogénea de sustrato acompañante interacciones^{32,33, 34,35,36,37}. Sin embargo, acompañantes regulados por el estrés tienen una oportunidad para avanzar en nuestra comprensión de la función de la agregación debido a su capacidad para: 1) obtener de dos formas diferentes de la acompañante, activo (p. ej., oxidada) e inactivos (por ejemplo, reducido), con la introducción o eliminación de una condición de estrés fácilmente cambiar entre ellos (p. ej., oxidante y reductor), 2) tiene una amplia gama de sustratos, 3) forman complejos muy estables con las proteínas de cliente que pueden ser evaluadas por diferentes metodologías estructurales y 4) se centran exclusivamente en el reconocimiento de sustrato y liberación, mediada por cambios conformacionales redox-dependientes, como la mayoría de estos acompañantes carece de la capacidad de plegado.

Aquí, analizamos la actividad contra la agregación de la bacteriana acompañante regulación redox de la Hsp33, un componente vital de los sistemas de defensa bacteriana contra la oxidación inducida por la proteína agregación²⁸. Cuando reduce, la Hsp33 es una proteína de unión a zinc firmemente doblada sin actividad de acompañante; sin embargo, cuando se exponen al estrés oxidativo, Hsp33 sufre cambios conformacionales extensos que exponen su sustrato Unión regiones^38,39. A la oxidación, el ion de zinc que está fuertemente enlazado a cuatro residuos de cisteína altamente conservados del dominio c-terminal es lanzado⁴⁰. Esto resulta en la formación de enlaces de disulfuro dos, un despliegue de dominio C-terminal y una desestabilización de la región adyacente vinculador del⁴¹. Las regiones c-terminal y linker son altamente flexibles y se definen como intrínsecamente o parcialmente desordenado. Regreso a condiciones de estrés no, quedar reducidos las cisteínas y el acompañante vuelve a su estado doblado nativo sin actividad contra la agregación. El refolding de la acompañante conduce a un mayor despliegue y desestabilización de la proteína de clientes consolidados, que desencadena su transferencia al sistema canónicas acompañante, DnaK/J, para repliegue³⁸. Análisis de sitios de interacción de Hsp33 sugiere que Hsp33 usos tanto desordenado su cargada regiones así como las regiones hidrofóbicas en el vinculador y el dominio N-terminal para capturar mal proteínas de cliente y evitar su agregación^{38, 42}. en el estado doblado, estas regiones están ocultos por el vinculador doblado y el dominio C-terminal. Curiosamente, la región de linker sirve como guardián de estado plegado e inactivo de Hsp33 “sensing” el estado plegado de su lado de dominio C-terminal³⁴. Una vez desestabilizado por mutagénesis (ya sea por una mutación de punto o una perturbación de la secuencia completa), Hsp33 se convierte en un acompañante constitutivamente activo independientemente el estado redox de sus cisteínas redox-sensibles⁴³.

Los protocolos presentados aquí permiten monitoreo de actividad redox dependiente acompañante de Hsp33, así como cambios conformacionales mapeo sobre la activación y Unión de proteínas del cliente. Esta metodología se puede adaptar a investigación otros modelos de reconocimiento de acompañante del cliente así como las interacciones proteína-proteína de acompañante no. Por otra parte, se presentan los protocolos para la preparación de acompañantes totalmente reducidas y oxidadas que pueden utilizarse en estudios de otras proteínas redox-switch, para revelar el papel potencial de la oxidación de la proteína sobre la actividad de la proteína.

Específicamente, se describe un procedimiento para monitorear actividad chaperona en vitro y definir su especificidad de sustrato bajo diferentes tipos de agregación de la proteína (químicamente o térmicamente inducida) con dispersión de la luz (LS) medida por un fluorospectrometer⁴⁴. Durante la agregación, dispersión de luz en 360 nm aumenta rápidamente debido a la creciente turbiedad. Por lo tanto, la agregación puede ser monitoreada en forma dependiente del tiempo en esta longitud de onda. LS es un método rápido y sensible para las pruebas de agregación de la proteína y, por tanto, la actividad contra la agregación de una proteína de interés usando concentraciones nanomolares, lo que permite la caracterización de los parámetros cinéticos relacionados con la agregación de proteína bajo diferentes condiciones. Además, el protocolo de LS descrito aquí no requiere la instrumentación costosa y puede establecerse fácilmente en cualquier laboratorio.

Sin embargo, es muy difícil obtener curvas cinéticas “limpio” y obtener parámetros cinéticos de la proteína de tal luz dispersión de experimentos, debido al ruido y la gran cantidad de afloramientos generada por las burbujas de aire y los grandes agregados. Para superar este obstáculo, presentamos una nueva herramienta gráfica, Kfits⁴⁵, utilizada para reducir niveles de ruido en diferentes medidas cinéticas, equipados específicamente para datos cinéticos de la agregación de proteínas. Este software proporciona parámetros cinéticos preliminares para una primera evaluación de los resultados y le permite “limpiar” grandes cantidades de datos rápidamente sin afectar sus propiedades cinéticas. Kfits es implementado en Python y está disponible en código abierto a ⁴⁵.

Una de las preguntas difíciles en el campo se refiere a la asignación de sitios de interacción entre acompañantes y sus proteínas de cliente y entender cómo acompañantes reconocen una amplia gama de sustratos mal plegadas. Esta pregunta es más complicada cuando el estudio de complejos de proteína altamente dinámicos que implican intrínsecamente desordenada acompañantes y propensas a la agregación de sustratos. Afortunadamente, espectrometría de masas estructural ha avanzado considerablemente en la última década y ha proporcionado con éxito enfoques útiles y herramientas para analizar la plasticidad estructural y mapa de residuos implicados en el reconocimiento de la proteína^{46, 47 , 48 , 49}., presentamos aquí un tal cambio de técnica-hidrógeno-deuterio espectrometría de masas (HDX-MS)-que permite el mapeo de cambios del nivel del residuo en una conformación estructural sobre modificación de la proteína o proteína/ligando vinculante^{35, 50,51,52,53,54,55}. HDX-MS utiliza el intercambio continuo de hidrógenos de la columna vertebral por deuterio, la tasa de que se ve afectada por el ambiente químico, accesibilidad, y covalentes y no covalentes⁵⁶. HDX-MS pistas de estos procesos de cambio utilizando un disolvente deuterado, comúnmente agua pesada (D₂O) y permite la medición basada en el cambio de peso molecular tras el hidrógeno al intercambio de deuterio. Más lenta tasa de intercambio hidrógeno-deuterio puede resultar de hidrógenos participar en enlaces de hidrógeno o, simplemente, de impedimento estérico, que indica los cambios locales en estructura⁵⁷. Cambios a un ligando o modificaciones post-traduccionales también pueden conducir a diferencias en el entorno de hidrógeno, con un enlace lo que resulta en diferencias en el hidrógeno-deuterio intercambio (HDX) tarifas^46,53.

Hemos aplicado esta tecnología a las regiones 1) mapa Hsp33 que rápidamente desarrollan sobre oxidación, conduciendo a la activación de la Hsp33 y 2) definen la interfaz de enlace potencial de la Hsp33 con su cuerpo entero sustrato mal plegada, citrato sintetasa (CS)³⁸.

Los métodos descritos en este manuscrito pueden aplicarse para estudiar funciones redox-dependientes de las proteínas en vitro, definiendo la actividad contra la agregación y la función de los cambios estructurales (si cualquiera) en función de la proteína. Estas metodologías pueden ser fácilmente adaptadas a diversos sistemas biológicos y aplicadas en el laboratorio.