Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio

Le cellule incontrano spesso un accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS) prodotte come sottoprodotti di respirazione^1,2, proteica e lipidica ossidazione^3,4e processi aggiuntivi^{5, 6,7}. Nonostante il ruolo benefico di ROS’ in diversi processi biologici quali^8,9 e risposta immunitaria¹⁰di segnalazione cellulare, uno squilibrio fra produzione di ROS e la sua disintossicazione potrebbe verificarsi, portando a ossidativo ⁷di sforzo. I bersagli biologici di ROS sono proteine, lipidi e degli acidi nucleici, l’ossidazione di cui influenzare la loro struttura e funzione. Pertanto, l’accumulo degli ossidanti cellulari è fortemente legata a una vasta gamma di patologie tra cui cancro^9,11, infiammazione^12,13e invecchiamento^{14, 15}e sono stati trovati per essere coinvolti nell’insorgenza e progressione dei disordini neurodegenerative quali Alzheimer, Parkinson e ALS malattia^16,17,18.

Proteine sia recentemente sintetizzate e mature sono altamente sensibili all’ossidazione a causa delle alterazioni potenzialmente nocive delle loro catene laterali, che forma la proteina struttura e funzione^19,20. Pertanto, lo sforzo ossidativo conduce solitamente ad un’inattivazione della proteina diffusa, misfolding e aggregazione, finalmente conducendo alla morte delle cellule. Una delle strategie cellulare elegante per affrontare il danno potenziale di ossidazione della proteina è quello di utilizzare chaperoni redox-dipendente, che inibiscono l’aggregazione proteica diffusa, invece di formare complessi stabili con le proteine misfolded client^{21 ,22,23}. Questi accompagnatori di prima linea di difesa sono rapidamente attivati da un’ossidazione site-specific (solitamente sui residui di cisteina) che li converte in potenti molecole anti-aggregazione²⁴. Poiché lo sforzo ossidativo provoca l’inibizione della respirazione e una diminuzione nell’ATP cellulare livelli²⁵, canonico ATP-dipendente chaperoni sono meno efficaci durante lo sforzo ossidativo condizioni^{25,26 ,27}. Di conseguenza, redox-attiva chaperoni ATP-indipendente giocano un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi della proteina sull’accumulo degli ossidanti nei batteri e negli eucarioti (ad es., Hsp33²⁸ e RidA²⁹ nei batteri, Get3³⁰ in lievito, le perossiredossine³¹ negli eucarioti). L’attività di questi accompagnatori dipende fortemente reversibili strutturali cambiamenti conformazionali indotti da un’ossidazione site-specific che scopre idrofobiche regioni coinvolte nel riconoscimento delle proteine misfolded client.

Ricerca del meccanismo anti-aggregazione e i principi che disciplinano il riconoscimento delle proteine client di chaperoni non è facile a causa della natura dinamica ed eterogeneo di chaperone-substrato interazioni^{32,33, 34,35,36,37}. Tuttavia, lo stress-regolata con i supervisori hanno l’opportunità di avanzare la nostra comprensione della funzione anti-aggregazione dovuto la loro capacità di: 1) ottenere due forme differenti di chaperone, attivo (ad es., ossidato) e inattivo (ad es., ridotto), con l’introduzione o la rimozione di una condizione di stress passare facilmente tra loro (ad es., ossidante e riducente), 2) hanno una vasta gamma di substrati, 3) formano complessi molto stabili con le proteine di client che possono essere valutate mediante diverse metodologie strutturali e 4) concentrarsi esclusivamente sul substrato riconoscimento e rilascio, mediato dai cambiamenti conformazionali redox-dipendente, come la maggior parte di questi accompagnatori manca la capacità pieghevole.

Qui, analizziamo le attività anti-aggregazione del chaperone redox-regolati batterica di Hsp33, una componente essenziale del sistema di difesa batterica contro proteina indotta da ossidazione aggregazione²⁸. Quando ridotto, Hsp33 è una proteina di zinco-leganti strettamente piegata con nessuna attività di chaperone; Tuttavia, quando esposte a stress ossidativo, Hsp33 subisce vasti cambiamenti conformazionali che espongono il relativo substrato associazione regioni^38,39. Sopra l’ossidazione, lo ione di zinco che è fortemente associato a quattro residui di cisteina altamente conservata del dominio C-terminale è rilasciato⁴⁰. Questo provoca la formazione di due ponti disolfuro, uno spiegamento del dominio C-terminale e una destabilizzazione della regione adiacente del linker⁴¹. Regioni del C-terminale e del linker sono altamente flessibili e sono definite come intrinsecamente o parzialmente disordinati. Al ritorno in condizioni di non-stress, le cisteine diventano ridotto e il chaperone ritorna al suo stato nativo piegato senza attività anti-aggregazione. Il ripiegamento del chaperone conduce ad un ulteriore svolgimento e destabilizzazione della proteina client associato, che innesca il suo trasferimento al sistema chaperone canonico, DnaK/J, per refolding³⁸. Analisi dei siti di interazione di Hsp33 suggeriscono che Hsp33 usi entrambi che suoi carica disordinata le regioni, come pure le regioni idrofobiche sul linker e il dominio N-terminale di catturare “misfolded” proteine di client e impediscono loro di aggregazione^{38, 42}. in stato piegato, queste regioni sono nascoste per il linker piegato e il dominio C-terminale. È interessante notare che, la regione di linker funge da un gatekeeper di stato piegato e inattivo di Hsp33, lo stato pieghevole della sua adiacente di dominio C-terminale³⁴“sensing”. Una volta che ha destabilizzato mediante mutagenesi (sia da una mutazione di punto o di una perturbazione di sequenza completa), Hsp33 viene convertito in un chaperone costitutivamente attivo indipendentemente lo stato redox della sua redox-sensibili cisteine⁴³.

I protocolli qui presentati consentono di monitoraggio di attività di chaperone di redox-dipendente di Hsp33, nonché dei cambiamenti conformazionali di mappatura all’attivazione del e associazione di proteine di client. Questa metodologia può essere adattata per ricercare altri modelli di riconoscimento di chaperone-client così come le interazioni non-chaperone proteina-proteina. Inoltre, vi presentiamo i protocolli per la preparazione di chaperoni completamente ossidati e ridotti che può essere utilizzato negli studi di altre proteine redox-interruttore, per rivelare potenziali ruoli dell’ossidazione della proteina su attività della proteina.

In particolare, descriviamo una procedura per monitorare chaperone attività in vitro e definire la sua specificità di substrato sotto diversi tipi di aggregazione proteica (indotta chimicamente o termicamente), utilizzando la diffrazione della luce (LS) misurato da un fluorospectrometer⁴⁴. Durante l’aggregazione, light scattering a 360 nm aumenta rapidamente a causa della torbidità crescente. Così, l’aggregazione può essere monitorata in modo dipendente dal tempo a questa lunghezza d’onda. LS è un metodo veloce e sensibile per i test di aggregazione proteica e quindi l’attività anti-aggregazione di una proteina di interesse utilizzando concentrazioni nanomolari, consentendo la caratterizzazione delle proteine correlate a aggregazione parametri cinetici sotto diversi condizioni. Inoltre, il protocollo di LS qui descritto non richiede strumentazione costosa e può stabilire facilmente in qualsiasi laboratorio.

Tuttavia, è abbastanza impegnativo per ottenere curve cinetiche “pulito” e derivare i parametri cinetici di una proteina da tali esperimenti, a causa di rumore e il gran numero di valori anomali generati da bolle d’aria e grandi aggregati di diffusione della luce. Per superare questo ostacolo, vi presentiamo un nuovo strumento grafico, Kfits⁴⁵, utilizzato per ridurre i livelli di rumore in diverse misure cinetiche, specificamente attrezzati per dati cinetici di aggregazione di proteine. Questo software fornisce parametri cinetici preliminari per una prima valutazione dei risultati e consente all’utente di “pulire” grandi quantità di dati rapidamente senza influire sulle proprietà cinetiche. Kfits è implementato in Python ed è disponibile in open source ⁴⁵.

Una delle domande difficili nel campo riguarda mappatura siti di interazione tra accompagnatori e le loro proteine di client e la comprensione come chaperoni riconoscono una vasta gamma di substrati misfolded. Questa domanda è ulteriormente complicato quando lo studio di complessi di proteine altamente dinamico che comportano intrinsecamente disordinati chaperoni e substrati aggregazione-incline. Fortunatamente, spettrometria di massa strutturale ha avanzato notevolmente nell’ultimo decennio e con successo ha fornito utili approcci e strumenti per analizzare la plasticità strutturale e mappa residui coinvolti nella proteina riconoscimento^{46, 47 , 48 , 49}. qui, presentiamo un tale cambio di tecnica-idrogeno-deuterio spettrometria di massa (HDX-MS)-che consente la mappatura delle modifiche a livello di residui in una conformazione strutturale su modifica della proteina o proteina/ligando associazione^{35, 50,51,52,53,54,55}. HDX-MS utilizza lo scambio continuo di atomi di idrogeno spina dorsale di deuterio, la cui aliquota è influenzata dall’ambiente chimico, accessibilità, e covalenti e non covalenti⁵⁶. HDX-MS tiene traccia di questi processi di exchange utilizzando un solvente deuterato, comunemente acqua pesante (D₂O) e consente di misurazione basato sul cambiamento di peso molecolare seguendo l’idrogeno per cambio di deuterio. Velocità di scambio di idrogeno-deuterio può derivare da atomi di idrogeno che partecipano a legami idrogeno o, semplicemente, da sterico, che indica le modifiche locali nella struttura⁵⁷. Modifiche su un ligando o modificazioni post-traduzionali possono anche portare a differenze nell’ambiente di idrogeno, con un’associazione con conseguente differenze per quanto riguarda il cambio (HDX) di idrogeno-deuterio tariffe^46,53.

Abbiamo applicato questa tecnologia nelle regioni 1) Mappa Hsp33 che rapidamente si svolgono sopra l’ossidazione, che portano all’attivazione di Hsp33, 2) definire l’interfaccia di associazione potenziale di Hsp33 con il suo substrato misfolded full-length, citrato sintasi (CS)³⁸.

I metodi descritti in questo manoscritto possono essere applicati per studiare funzioni redox-dipendente di proteine in vitro, definire attività anti-aggregazione e il ruolo dei cambiamenti strutturali (se qualsiasi) in funzione della proteina. Queste metodologie possono essere facilmente adattate a diversi sistemi biologici e applicate in laboratorio.