Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Zellen haben häufig eine Ansammlung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) produziert als Nebenprodukte der Atmung^1,2, Protein und Lipid Oxidation^3,4und zusatzprozesse^{5, 6,7}. Trotz ROS positive Rolle im vielfältigen biologischen Prozessen wie Mobilfunk Signalisierung^8,9 und Immunantwort¹⁰auftreten ein Ungleichgewicht zwischen ROS-Produktion und die Entgiftung, führen zu oxidativen betonen Sie⁷. Die biologische Ziele von ROS sind Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die Oxidation von denen beeinflussen, ihrer Struktur und Funktion. Daher ist die Anhäufung von zellulären Oxidantien stark an ein breites Spektrum von Krankheiten einschließlich Krebs^9,11, Entzündung^12,13und Altern^14, gebunden. ¹⁵, und habe bei der Entstehung und Progression von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und ALS Krankheit^16,17,18einbezogen werden.

Neu synthetisierten und Reifen Proteine sind sehr anfällig für Oxidation durch die potenziell schädlichen Änderungen ihrer Seitenketten, die Protein-Struktur und Funktion^19,20prägen. Oxidativer Stress führt daher meist zu eine weit verbreitete Protein Inaktivierung, Fehlfaltung und Aggregation, was schließlich zum Zelltod. Eines der eleganten zellulären Strategien zur Bewältigung des potenziellen Schadens der Protein-Oxidation ist Redox-abhängige Chaperone, zu verwenden, die die weit verbreitete Proteinaggregation, statt zu bilden stabile komplexe mit Client fehlgefaltete Proteine^{21 hemmen ,22,23}. Diese erste Verteidigungslinie Chaperone sind schnell durch eine ortsspezifische Oxidation (in der Regel auf Cystein Rückstände) aktiviert, die sie potente anti-Aggregation Moleküle²⁴umwandelt. Da oxidativer Stress in der Hemmung der Atmung und sinkt in der zellulären ATP Niveaus²⁵führt, sind kanonische ATP-abhängige Chaperone weniger wirksam bei oxidativem Stress Bedingungen^{25,26 ,27}. Redox-aktivierte ATP-unabhängige Chaperone spielen daher eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Protein auf die Anhäufung von Oxidantien in Bakterien und Eukaryoten (z.B., Hsp33²⁸ und RidA²⁹ in Bakterien, Get3³⁰ in der Hefe, Peroxiredoxins³¹ in den Eukaryotes). Die Aktivität der diese Chaperone hängt stark von reversible strukturelle Konformationsänderungen induziert durch eine ortsspezifische Oxidation, die hydrophobe Regionen an der Anerkennung der Client fehlgefaltete Proteine beteiligt deckt.

Forschung von der Anti-Aggregation-Mechanismus und die Grundsätze für die Anerkennung der Client Proteine durch Chaperone ist nicht einfach aufgrund der dynamischen und heterogene Charakter der Chaperon-Substrat Interaktionen^{32,33, 34,35,36,37}. Stress-regulierten Chaperone haben jedoch die Möglichkeit, unser Verständnis von der Anti-Aggregationsfunktion aufgrund ihrer Fähigkeit,: 1) zwei verschiedene Formen der Chaperon (z.B.oxidiert) aktiv und inaktiv (z. B.zu erhalten (reduziert), bei der Einführung oder Entfernung einer Stress-Bedingung, die einfache Umschaltung zwischen ihnen (z.B., Oxidationsmittel und Reduktionsmittel), 2) verfügen über eine breite Palette von Substraten, 3) bilden sehr stabile komplexe mit den Client-Proteinen, die durch ausgewertet werden können verschiedenen strukturellen Methoden, und 4) konzentrieren sich ausschließlich auf das Substrat Anerkennung und Freigabe, vermittelt durch Konformationsänderungen Redox-abhängige, da der Großteil dieser Chaperone die Faltung Fähigkeit fehlt.

Hier analysieren wir die bakterielle Redox-regulierten Chaperon Hsp33 Anti-Aggregation Aktivität, ein wesentlicher Bestandteil des bakteriellen Verteidigungssystems gegen Oxidation-induzierte Protein Aggregation²⁸. Wenn reduziert, ist Hsp33 ein dicht gefaltet Zink-bindendes Protein ohne Chaperon-Aktivität; jedoch beim oxidativen Stress ausgesetzt, durchläuft Hsp33 umfangreiche Konformationsänderungen die seine Substrat Bindung Regionen^38,39aussetzen. Bei der Oxidation ist die Zink-Ionen, die stark an vier hoch konservierten Cystein-Reste von der C-terminalen Domäne gebunden ist freigegeben⁴⁰. Dies führt zur Bildung von zwei Disulfid-Bindungen, eine Entfaltung der C-terminalen Domäne und eine Destabilisierung des angrenzenden Linker Region⁴¹. Die C-terminale und Linker Regionen sind sehr flexibel und sind definiert als intrinsisch oder teilweise ungeordnet. Nach Rückkehr nach non-Stress-Bedingungen die Cysteine werden reduziert und das Chaperon wieder auf native zusammengeklapptem Zustand ohne Anti-Aggregation-Aktivität. Die umfaltung der Chaperon führt zu einer weiteren Entfaltung und Destabilisierung des Proteins gebundenen Kunden, die ihre Übergabe an die kanonische Chaperon-System DnaK/J, umfaltung³⁸auslöst. Analyse der Hsp33s Interaktion Seiten legt nahe, dass Hsp33 verwendet beide, die Regionen sowie die hydrophoben Regionen auf Linker und N-terminale Domäne erfassen ihrer geladenen ungeordneten Proteine Client misfolded und verhindern deren Aggregation^{38, 42}. im zusammengeklappten Zustand sind diese Regionen durch die gefalteten Linker und C-terminale Domäne versteckt. Interessant ist, dient die Linker-Region als Gatekeeper der Hsp33s gefalteten und inaktiven Zustand, den klappbaren Status seiner benachbarten C-terminale Domäne³⁴“sensing”. Sobald durch Mutagenese (entweder durch eine Punktmutation oder eine vollständige Sequenz Störung) destabilisiert, wird Hsp33 in ein konstitutiv aktiv Chaperon unabhängig Redox Bundesstaat seine Redox-Sensitive Cysteine⁴³konvertiert.

Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen Überwachung der Redox-abhängige Chaperone Aktivität Hsp33s sowie Zuordnung Konformationsänderungen auf die Aktivierung und Bindung von Kunden Proteine. Diese Methodik kann andere Chaperon-Client Anerkennung Modelle als auch nicht-Chaperon-Protein-Protein-Wechselwirkungen Forschung angepasst werden. Darüber hinaus präsentieren wir Protokolle für die Zubereitung von vollständig reduzierte und oxidierte Chaperone, die in den Studien von anderen Proteinen Redox-Schalter verwendet werden können, um mögliche Rollen der Protein-Oxidation auf die proteinaktivität zu offenbaren.

Im einzelnen beschreiben wir ein Verfahren zur Überwachung Chaperon Aktivität in Vitro und definieren die Substratspezifität unter verschiedenen Arten von Proteinaggregation (chemisch oder thermisch induzierte) mit Lichtstreuung (LS) gemessen an einem Fluorospectrometer⁴⁴. Während der Anhäufung Licht Streuung bei 360 nm erhöht sich rasch durch die zunehmende Trübung. Somit kann Aggregation in einer zeitabhängigen Weise bei dieser Wellenlänge überwacht werden. LS ist eine schnelle und empfindliche Methode zum Testen von Proteinaggregation und somit die Anti-Aggregation-Aktivität eines Proteins des Interesses mit nanomolaren Konzentrationen, sodass die Charakterisierung von Protein Aggregation-kinetische Parameter unter verschiedenen Bedingungen. Darüber hinaus das hier beschriebene LS-Protokoll erfordert keine teuren Instrumentierung und kann problemlos in jedem Labor hergestellt werden.

Dennoch ist es ziemlich schwierig, “saubere” kinetischen Kurven zu erhalten und solche Lichtstreuung Experimente, wegen Lärm und die große Zahl der Ausreißer von Luftblasen und großen Aggregaten erzeugt ein Protein kinetische Parameter abgeleitet. Um dieses Hindernis zu überwinden, präsentieren wir ein neues grafisches Tool, Kfits⁴⁵, für Lärmbelastung in verschiedene kinetische Messungen, speziell ausgestattet für Protein Aggregation kinetische Daten verwendet. Diese Software bietet vorläufige kinetische Parameter für eine frühzeitige Bewertung der Ergebnisse und erlaubt dem Benutzer, “große Datenmengen schnell reinigen” ohne seine kinetischen Eigenschaften. Kfits ist in Python implementiert und in open Source bei ⁴⁵erhältlich.

Eine der schwierigen Fragen im Bereich bezieht sich auf mapping Interaktion stellen zwischen Betreuer und ihre Client-Proteine und das Verständnis, wie Chaperone eine Vielzahl von fehlgefaltete Substraten erkennen. Diese Frage ist komplizierter, wenn Studium hochdynamische Proteinkomplexe, die per se beinhalten Chaperone und Aggregation neigende Substrate ungeordnet. Glücklicherweise, strukturelle Massenspektrometrie hat in den letzten zehn Jahren drastisch fortgeschritten und hat erfolgreich hilfreiche Ansätze und Instrumente zur Analyse der strukturelle Plastizität und Karte Rückstände an Protein Anerkennung^{46, 47 , 48 , 49}. hier präsentieren wir eine solche Technik-Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie (HDX-MS)-die erlaubt die Zuordnung der Rückstandsgehalt Änderungen in eine strukturelle Anpassung auf Protein-Modifikation oder Protein/Ligand verbindlichen^{35, 50,51,52,53,54,55}. HDX-MS nutzt den kontinuierlichen Austausch von Rückgrat Wasserstoffatome durch Deuterium, die Rate von denen ist von der chemischen Umgebung, Erreichbarkeit, betroffen, und kovalente und nicht-kovalente Bindungen⁵⁶. HDX-MS verfolgt diese Austauschprozesse mit einem deuterierte Lösungsmittel, häufig Schweres Wasser (D₂O) und ermöglicht die Messung basiert auf der Veränderung der Molekulargewicht der Wasserstoff zu Deuterium Austausch nach. Langsamere Rate der Wasserstoff-Deuterium Austausch führt aus Wasserstoffatome an Wasserstoffbindungen teilnehmen oder einfach aus sterische Behinderung, die lokale Veränderungen in Struktur⁵⁷angibt. Änderungen auf ein Ligand-Bindung oder Post-translationalen Modifikationen führen auch zu Unterschieden in der Wasserstoff-Umgebung mit einer Bindung, die resultierenden Unterschiede in der Wasserstoff-Deuterium Austausch (HDX) Preise^46,53.

(1) Karte Hsp33 Regionen, die rasch entfalten auf Oxidation, führt zur Aktivierung des Hsp33, und (2) definieren die mögliche verbindliche Schnittstelle des Hsp33 mit seinem Full-Length fehlgefaltete Substrat, Citrat-Synthase (CS)³⁸haben wir diese Technologie angewendet.

In diesem Manuskript beschriebenen Methoden können angewendet werden, um Redox-abhängige Funktionen der Proteine in Vitro, Definition Anti-Aggregation-Aktivität und die Rolle der strukturellen Veränderungen (falls vorhanden) in Proteinfunktion zu studieren. Diese Methoden können leicht verschiedene biologische Systeme angepasst und angewendet im Labor.