Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

Cellen tegenkomen vaak een opeenstapeling van reactieve zuurstof soorten (ROS) geproduceerd als bijproduct van de ademhaling^1,2, eiwit en lipide oxidatie^3,4en extra processen^{5, 6,7}. Ondanks ROS gunstig rol in verschillende biologische processen zoals mobiele signalering van^8,9 en immuunrespons¹⁰, kan een gebrek aan evenwicht tussen ROS productie en de ontgifting optreden, toonaangevende aan oxidatieve ⁷benadrukken. De biologische doelstellingen van ROS zijn eiwitten en lipiden, nucleïnezuren, de oxidatie van die invloed hebben op hun structuur en functie. Daarom is de accumulatie van cellulaire oxidanten sterk gekoppeld aan een breed scala aan ziektebeelden zoals kanker^9,11, ontsteking^12,13en veroudering^{14, 15}, en hebben gevonden te worden betrokken bij het ontstaan en de progressie van neurodegeneratieve aandoeningen zoals Alzheimer, Parkinson van, en de ALS ziekte^16,17,18.

Zowel nieuw samengestelde en volwassen eiwitten zijn zeer gevoelig voor oxidatie als gevolg van de potentieel schadelijke wijzigingen van hun zijketens, die vorm van eiwit structuur en functie^19,20. Daarom leidt oxidatieve stress meestal tot een wijdverbreide eiwit geïnactiveerd, de misfolding en de aggregatie, uiteindelijk zal leiden tot celdood. Een van de elegante cellulaire strategieën om te gaan met de potentiële schade van eiwit oxidatie is te gebruiken van redox-afhankelijke chaperones, die de wijdverbreide eiwit aggregatie remmen, in plaats van het vormt stabiele complexen met misfolded client eiwitten^{21 ,22,23}. Deze eerstelijns defensie chaperones worden snel geactiveerd door een sitespecifieke oxidatie (meestal op cysteïne residuen) dat in krachtige anti-aggregatie moleculen^{24 omgezet}. Aangezien oxidatieve stress in de remming van de ademhaling en dalingen in de cellulaire ATP niveaus^{25 leidt}, zijn canonieke ATP-afhankelijke chaperones minder effectief tijdens oxidatieve stress voorwaarden^{25,26 ,27}. Daarom, redox-geactiveerde ATP-onafhankelijke chaperones spelen een cruciale rol bij het handhaven van de homeostase van het eiwit op de accumulatie van oxidanten in bacteriën en eukaryoten (b.v., Hsp33²⁸ en RidA²⁹ bij bacteriën, Get3³⁰ in gist, peroxiredoxins³¹ in eukaryoten). De activiteit van deze chaperones is sterk afhankelijk van omkeerbare structurele conformationele veranderingen geïnduceerd door een sitespecifieke oxidatie die hydrofobe regio’s die betrokken zijn bij de erkenning van misfolded client eiwitten onthult.

Onderzoek van de anti-aggregatie-mechanisme en de beginselen inzake de erkenning van de client-eiwitten door chaperones is niet eenvoudig als gevolg van het dynamische en heterogenic karakter van de Chaperon-substraat interacties^{32,33, 34,35},^,36,^,37. Stress-gereglementeerde chaperones hebben echter een kans om ons begrip van de anti-aggregatie functie vanwege hun vermogen om: 1) verkrijgen van twee verschillende vormen van de Chaperon, actief (bijvoorbeeldgeoxideerd) en inactief (b.v. verminderd), met de invoering of de verwijdering van een aandoening van de stress gemakkelijk schakelen tussen hen (bv, oxidator en reducerende agent), 2) hebben een breed scala van substraten, 3) zeer stabiele complexen vormen met de client-eiwitten die kunnen worden geëvalueerd door verschillende structurele methodologieën, en 4) uitsluitend richten op het substraat erkenning en introductie, gemedieerd door redox-afhankelijke conformationele veranderingen, zoals de meerderheid van deze chaperones het vouwen vermogen ontbreekt.

Here, analyseren we de bacteriële redox-gereglementeerde chaperone Hsp33 van anti-aggregatie activiteit, een essentieel onderdeel van het bacteriële verdedigingssysteem tegen oxidatie-geïnduceerde proteïne aggregatie²⁸. Wanneer verlaagd, is Hsp33 een strak gevouwen zink-bindend-proteïne met geen chaperone activiteit; echter wanneer blootgesteld aan oxidatieve stress, ondergaat Hsp33 uitgebreide conformationele veranderingen die haar substraat bindende regio’s^38,39blootstellen. Op oxidatie is het zink ion dat sterk aan vier zeer geconserveerde cysteïne residuen van het C-terminal domein gebonden is vrijgegeven⁴⁰. Dit resulteert in de vorming van twee disulfide bindingen, een ontplooiing van de C-terminal domein, en een destabilisering van de aangrenzende linker regio⁴¹. De C-terminal en linker regio’s zijn zeer flexibel en worden gedefinieerd als intrinsiek of gedeeltelijk ontregelde. Bij terugkeer naar niet-stress voorwaarden, de cysteines worden verminderd en de Chaperon keert terug naar zijn geboortestaat gevouwen met geen anti-aggregatie-activiteit. Het uiteinde van de Chaperon leidt tot een verdere ontplooiing en destabilization van de afhankelijke client proteïne, die de overdracht aan de canonieke chaperone systeem, DnaK/J, voor uiteinde³⁸triggers. Analyse van de Hsp33 interactie sites suggereert dat Hsp33 gebruikt beide die zijn geladen ontregelde regio’s, alsmede de hydrofobe regio’s over het linker en het N-terminaal domein te vangen misfolded client eiwitten en voorkomen hun aggregatie^38, dat ⁴². in gevouwen toestand, deze regio’s zijn verborgen door de gevouwen linker en C-terminal domein. Interessant is dat fungeert de linker regio als poortwachter van Hsp33 van gevouwen en inactieve staat, “sensing” de opvouwbare status van de aangrenzende C-terminal domein³⁴. Zodra gedestabiliseerd door mutagenese (hetzij door een mutatie van de punt of een volledige reeks perturbation), wordt Hsp33 geconverteerd naar een constitutively actieve chaperone ongeacht de redox staat van haar redox-sensitive cysteines⁴³.

De hier gepresenteerde protocollen toestaan monitoring van Hsp33 de redox-afhankelijke chaperone activiteit, evenals de conformationele wijzigingen van de toewijzing na de activatie en binden van eiwitten van de client. Deze methode kan worden aangepast aan het onderzoek andere chaperon-client erkenning modellen evenals niet-chaperone eiwit-eiwitinteractie. Bovendien presenteren wij protocollen voor de bereiding van volledig gereduceerde en de geoxideerde chaperones die kunnen worden gebruikt in studies van andere redox-switch eiwitten, te onthullen van de potentiële rol van eiwit oxidatie op de activiteit van het eiwit.

Specifiek, beschrijven we een procedure om te controleren chaperone activiteit in vitro en definiëren van zijn substraat specificiteit uit hoofde van verschillende soorten eiwit aggregatie (chemisch of thermisch geïnduceerde) met behulp van de verstrooiing van licht (LS) gemeten door een fluorospectrometer⁴⁴. Tijdens de samenvoeging, licht verstrooiing op 360 nm stijgt snel als gevolg van de toenemende turbiditeit. Zo kan aggregatie worden gecontroleerd op een tijd-afhankelijke manier bij deze golflengte. LS is een snelle en gevoelige methode voor het testen van de aggregatie van eiwitten en dus de activiteit van de anti-aggregatie van een proteïne van belang met behulp van nanomolar concentraties, waardoor de karakterisering van proteïne aggregatie-gerelateerde kinetische parameters onder verschillende voorwaarden. Bovendien, het LS-protocol beschreven hier vereist geen dure instrumentatie, en kan gemakkelijk worden vastgesteld in een laboratorium.

Het is echter vrij uitdagend om te verkrijgen ‘schone’ kinetische curven en voor het afleiden van een eiwit kinetische parameters van dergelijke licht verstrooiing experimenten, als gevolg van lawaai en het grote aantal uitschieters gegenereerd door luchtbellen en grote aggregaten. Om te overwinnen deze hindernis, presenteren we een nieuwe grafische tool, Kfits⁴⁵, ter vermindering van de geluidsniveaus in de verschillende kinetische metingen, speciaal uitgerust voor eiwit aggregatie kinetische gegevens gebruikt. Deze software levert voorontwerp kinetische parameters voor een vroege evaluatie van de resultaten en staat de gebruiker toe om “schoon” grote hoeveelheden data snel zonder de kinetische eigenschappen. Kfits is geïmplementeerd in Python en beschikbaar in open source op ⁴⁵.

Een van de uitdagende vragen op het gebied betreft aan sites van de interactie tussen chaperones en de proteïnen van hun cliënt in kaart te brengen en het inzicht hoe chaperones herkennen een breed scala van misfolded substraten. Deze vraag wordt nog ingewikkelder wanneer studeren hoogdynamische eiwitcomplexen waarbij intrinsiek chaperones en aggregatie-naar voren gebogen substraten ontregelde. Gelukkig, structurele massaspectrometrie dramatisch het laatste decennium heeft geavanceerde en heeft met succes nuttig benaderingen en hulpmiddelen voor het analyseren van de structurele plasticiteit en kaart van residuen die betrokken zijn bij eiwit erkenning^{46, 47 , 48 , 49}. hier, presenteren we een dergelijke techniek-waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS)-waarmee de toewijzing van residuen wijzigingen in een structurele bevestiging bij wijziging van de proteïne of eiwit/Ligand bindende^{35, 50,51,52,53},^,54,55. HDX-MS maakt gebruik van de voortdurende uitwisseling van ruggengraat waterstof door deuterium, het tarief van die wordt beïnvloed door de chemische milieu, toegankelijkheid, en covalente en niet-covalente bindingen⁵⁶. HDX-MS deze exchange-processen met behulp van een Halfzwaar oplosmiddel, vaak zwaar water (D₂van O) worden bijgehouden en kan waarderingsmethode op basis van de verandering in de moleculaire gewicht na het waterstof met deuterium exchange. Lagere tarieven van waterstof-deuterium exchange kunnen leiden tot van waterstof waterstofbruggen deelnemen of, gewoon, vanaf sterische hinder, waarin lokale wijzigingen in de structuur⁵⁷. Wijzigingen op een ligand binding of posttranslationele modificaties kunnen het ook leiden tot verschillen in de omgeving van waterstof, met een bindende voortvloeiende verschillen in de waterstof-deuterium uitwisseling (HDX) tarieven^46,53.

We deze technologie toegepast op 1) Hsp33 kaartregio die snel ontvouwen op oxidatie, wat leidt tot het activeren van Hsp33, en 2) het definiëren van de potentiële bindende interface van Hsp33 met zijn album misfolded substraat, citraat synthase (CS)³⁸.

De methoden die worden beschreven in dit manuscript kunnen worden toegepast om te studeren redox-afhankelijke functies van eiwitten in vitro, definiëren van anti-aggregatie activiteit en de rol van structurele veranderingen (indien van toepassing) in eiwitfunctie. Deze methodologieën kunnen gemakkelijk worden aangepast aan uiteenlopende biologische systemen en toegepast in het laboratorium.