Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée
Summary
La différenciation des adipocytes blancs et beiges de tissu adipeux progéniteurs vasculaire porte le potentiel d’amélioration métabolique dans l’obésité. Les auteurs décrivent des protocoles pour un CD34 + CD31 + isolation de cellules endothéliales de la graisse humaine ainsi qu’un subséquent in vitro de l’expansion et la différenciation en adipocytes blancs et beiges. Plusieurs applications en aval sont discutées.
Abstract
L’obésité s’accompagne d’un vaste remodelage du tissu adipeux principalement par l’intermédiaire de l’hypertrophie adipocytaire. Adipocyte extrême croissance résulte en une mauvaise réponse à l’insuline, l’hypoxie locale et l’inflammation. En stimulant la différenciation des adipocytes blancs fonctionnels de progéniteurs, hypertrophie radicale de la population d’adipocytes peut être évitée et, par conséquent, la santé métabolique du tissu adipeux peut être améliorée ainsi qu’une réduction de inflammation. En outre, en stimulant une différenciation des adipocytes beige/brun, la dépense d’énergie totale du corps peut être augmentée, entraînant une perte de poids. Cette approche pourrait prévenir le développement de co-morbidité de l’obésité comme les maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2.
Cet article décrit l’isolement, l’expansion et la différenciation des adipocytes blancs et beiges d’un sous-ensemble de cellules endothéliales de tissu adipeux humain qui expriment conjointement les marqueurs CD31 et CD34. La méthode est relativement bon marchée et n’est pas beaucoup de travail. Il requiert l’accès aux tissus adipeux humains et le dépôt sous-cutané est adapté pour l’échantillonnage. Pour ce protocole, les tissus adipeux frais échantillons provenant de sujets souffrant d’obésité morbide [indice de masse corporelle (IMC) > 35] sont collectées pendant les procédures de chirurgie bariatrique. À l’aide d’une immunoseparation séquentielle de la fraction stroma vasculaire, suffisamment de cellules est produites à aussi peu que 2 à 3 g de matières grasses. Ces cellules peuvent être développés en culture sur une période de 10 à 14 jours, peuvent être cryoconservés et conservent leurs propriétés adipocytaire avec passage jusqu’à passage 5-6. Les cellules sont traitées pendant 14 jours avec un cocktail à l’aide d’une combinaison de l’insuline humaine et l’agoniste-rosiglitazone PPARγ adipocytaire.
Cette méthode peut être utilisée pour l’obtention de preuve d’expériences de notion sur les mécanismes moléculaires qui animent les réponses adipocytaire dans les cellules endothéliales adipeuses, ou pour le dépistage des nouveaux médicaments qui peuvent augmenter l’adipocytaire réponse dirigée soit vers le blanc ou différenciation adipocytaire beige/marron. À l’aide de petites biopsies sous-cutanée, cette méthodologie permet d’écarter les sujets non-répondeur pour des essais cliniques visant à stimuler les adipocytes beige/marron et blancs pour le traitement de l’obésité et les comorbidités.
Introduction
Des données récentes montrent que, chez les souris et chez l’homme, un sous-ensemble de cellules résidant dans la vascularisation du tissu adipeux peut être différencié en soit les adipocytes blancs ou beige/marron1,2,3. Le phénotype de ces cellules est un sujet de controverse, avec preuves à l’appui des cellules endothéliales, musculaires lisses/pericyte ou un spectre de phénotypes intermédiaires4,5,6,7. Le champ d’application de cette méthodologie de développement était de tester le potentiel adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales isolées de différents dépôts gras contre les hommes obèses. D’autres études dans la littérature mettent l’accent sur le potentiel de la fraction totale de vasculaire stromale ou des progéniteurs adipocytaires connu2,8,9adipocytaire. Étant donné que les technologies existantes peuvent cibler spécifiquement les cellules endothéliales tissu adipeux pour drogue livraison10, compréhension du potentiel de ces cellules à subir adipocytaire induction vers les adipocytes blancs ou beiges est importante pour futures thérapies ciblées.
Différents groupes ont signalé la combinaison de marqueurs CD31 et CD34 comme substituts pour isoler les cellules endothéliales du tissu adipeux humain11,12,13. En règle générale, l’isolement est effectuée à l’aide de deux étapes séquentielles et une sélection positive à l’aide de billes magnétiques. Dans ce rapport, immunoseparation à l’aide de CD34 + billes magnétiques combinés avec des perles en plastique CD31 a été utilisée. Nous avons constaté que cette technique est supérieure à l’immunoseparation magnétique séquentielle en ce qui concerne la conservation de la morphologie endothéliale pavées typiques. Aussi, nous étions en mesure de produire suffisamment de cellules nécessaires à l’expansion et adipocytaire induction à partir d’aussi peu que 1 à 2 g de matières grasses. Une biopsie du petit échantillon de graisse sous-cutanée est suffisant pour produire la quantité requise de cellules pour les applications en aval. Cet aspect est potentiellement important, surtout si cette méthode sera utilisée pour le dépistage d’une réactivité à induction adipocytaire chez des sujets humains.
Contrairement aux autres systèmes rapportés dans la littérature, cette méthode utilise seulement deux ingrédients pour l’induction adipocytaire des cellules CD34 + CD31 + : un agoniste PPARγ — rosiglitazone — et l’insuline humaine. Ce qui est important, la quantité d’insuline utilisée correspond à la fourchette de normale/haute de circulation insuline post-absorptif chez les humains,14. Le degré de sensibilité à l’insuline du cellules in vitro, mesurée par la phosphorylation de l’Akt, n’est pas corrélée avec leur capacité de répondre à l’induction cocktail. Fait intéressant, un mélange de blancs et beige/marron de cellules en utilisant des conditions expérimentales et cocktail cette induction, ont été obtenues tel que déterminé par la taille et le nombre de gouttelettes de lipides intracellulaires et l’expression des marqueurs moléculaires. Ce protocole d’induction simple et rentable ainsi que l’évaluation quantitative du phénotype des cellules répondeur (blanc ou beige) permet un dépistage d’agents qui peuvent potentiellement modifier l’équilibre du beige différenciée : blanc d’adipocytes.
Cette méthode fournit également une approche translationnelle pour comprendre les mécanismes sous-jacents de l’adipogenèse des progéniteurs endothéliales vasculaires dans le tissu adipeux humain. Utilisant cette technique d’isolation/différenciation spécifique, les enquêteurs peuvent interroger diverses voies chargées de l’adipogenèse dans un sous-ensemble de cellules endothéliales vasculaires de différents dépôts de graisse chez l’homme maigre et obèses.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif de cet article est de fournir une méthodologie pour l’isolement, l’agrandissement et l’induction adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales de dépôts viscérales et sous-cutanée du tissu adipeux humain.
Méthodologies ont été rapportés pour l’isolement des cellules endothéliales de différents lits vasculaires des rongeurs ou des humains qui impliquent principalement les techniques utilisant des anticorps CD31 fluorescent étiquetés ou couplée à d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent reconnaître Becky Marquez, le coordonnateur clinique au centre de Bariatric Sentara, pour son aide avec le processus du patient dépistage et consentante. Cette recherche a été financée par R15HL114062 à Anca D. Dobrian.
Materials
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Large Equipment |
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Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
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Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
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|
Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
|
RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
|
Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
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|
Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
|
Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
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ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
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Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
|
Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
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|
Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
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Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
|
Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
|
KRBSS Buffer |
|||
|
HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
|
Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
|
Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
|
Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
|
Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
|
Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
|
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
|
Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
|
Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
|
Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
|
Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
|
Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
|
Tissue Digestion |
|||
|
20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
|
Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
|
Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
|
Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
|
Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
|
Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
|
Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
|
Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
|
Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
|
Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
|
Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
|
Cell Isolation |
|||
|
Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
|
Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
|
Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
|
Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
|
EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
|
Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
|
pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
|
pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
|
pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
|
pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
|
pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
|
Cell Culture |
|||
|
6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
|
4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
|
4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
|
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
|
Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
|
DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
|
Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
|
Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
|
Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
|
Cell Analysis |
|||
|
Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
|
96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
|
96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
|
RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
|
cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
|
JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
|
Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
|
dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
|
TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
|
TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
|
TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
|
TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
|
BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
|
Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
|
Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
|
TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
|
Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
|
Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
|
Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
|
EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
|
Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
|
Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
|
Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
|
Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
|
Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
|
Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
|
Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
|
37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
|
Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
|
DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
|
Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
|
Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
|
DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
Referências
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