Изоляция, расширение и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от человека сальниковый и подкожной жировой ткани
Summary
Дифференциация белых и бежевых адипоцитов из жировой ткани сосудистой прародителями медведи потенциал повышения метаболизма ожирения. Мы описываем протоколы для CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток изоляции из человеческого жира и последующих в vitro расширения и дифференцировку в белом и бежевом адипоцитов. Обсуждаются несколько нисходящие приложения.
Abstract
Ожирение сопровождается обширной реконструкции жировой ткани главным образом через Адипоцит гипертрофия. Экстремальные Адипоцит роста приводит к плохой ответ на инсулин, местные гипоксии и воспаления. Стимулируя дифференциация функциональных белый адипоцитов из прародителей, радикальные гипертрофия Адипоцит населения могут быть предотвращены, и, следовательно, метаболически здоровье жировой ткани могут быть улучшены наряду с сокращением воспаление. Кроме того стимулируя дифференциация бежевый/коричневый адипоциты, расходование энергии всего тела может быть увеличена, что приводит к потере веса. Этот подход может предотвратить развитие ожирения сопутствующие заболевания, такие как тип 2 диабет и сердечно-сосудистых заболеваний.
Этот документ описывает изоляции, расширение и дифференциации белых и бежевых адипоцитов из подмножества жировых тканях человека эндотелиальных клеток, которые совместно Экспресс CD31 и CD34 маркеров. Метод является относительно дешевым и не является трудоемким. Она требует доступа к человека жировой ткани и подкожные депо подходит для выборки. Для этого протокола, свежие жировой ткани образцов из morbidly ожирением предметы [индекс массы тела (ИМТ) > 35] собраны во время процедур бариатрической хирургии. Использование последовательных immunoseparation стромальные сосудистой фракции, достаточно клетки производятся из всего лишь 2-3 g жира. Эти клетки могут быть расширены в культуре в течение 10-14 дней, может быть криоконсервированных и сохраняют свои свойства адипогенном с пассированый до прохождения 5-6. Клетки обрабатываются в течение 14 дней с адипогенном коктейль, используя сочетание человеческого инсулина и PPARγ агонист Росиглитазон.
Эта методология может использоваться для получения доказательство концепции экспериментов на молекулярные механизмы, которые управляют адипогенном ответы в жировых клетках эндотелия, или для скрининга новых лекарств, которые могут повысить адипогенном ответ направлена либо на белый или бежевый/коричневый Адипоцит дифференциации. С помощью небольших подкожной биопсий, эта методология может использоваться для экрана-ответчик предметам для клинических испытаний, направленных на стимулирование бежевый/коричневый и белый адипоциты для лечения ожирения и сопутствующие заболевания.
Introduction
Последние данные показывают, что в мышей и людей, подмножество ячеек, проживающих в сосудистую жировой ткани могут быть продифференцированы в белый или бежевый/коричневый адипоцитов1,2,3. Фенотип таких клеток является предметом споров, с подтверждающей эндотелиальных клеток, гладкие мышцы/перицит или спектр промежуточных фенотипов4,5,6,7. Область разработки этой методологии было проверить адипогенном потенциал CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток, изолированных от различных жировых отложений из тучных людей. Другие исследования в литературе сосредоточены на адипогенном потенциал всего стромальные сосудистой дроби или известных Адипоцит прародителями2,8,9. Поскольку в настоящее время существующих технологий можно ориентировать конкретно эндотелиальные клетки жировой ткани для доставки наркотиков10, понимание потенциал таких клеток пройти адипогенном индукции к белый или бежевый адипоцитов имеет важное значение для будущее целевой терапии.
Различные группы сообщили сочетание CD31 и CD34 маркеры как суррогаты изолировать эндотелиальных клеток от жировых тканях человека11,12,13. Как правило изоляция выполняется с использованием двух последовательных шагов и положительный выбор с помощью магнитной бусины. В настоящем докладе была использована immunoseparation с помощью CD34 + магнитные шарики в сочетании с CD31 пластиковые бусины. Мы нашли этот метод превосходит последовательный магнитные immunoseparation в отношении сохранения типичных булыжником эндотелиальной морфологии. Кроме того мы были способны генерировать достаточно клеток, необходимых для расширения и адипогенном индукции, начиная от всего лишь 1 – 2 g жира. Небольшой пример биопсии подкожного жира достаточно производить необходимое количество клеток для нисходящие приложения. Этот аспект является потенциально важным, особенно, если этот метод будет использоваться для скрининга для оперативности адипогенном индукции в человеке.
В отличие от других систем, в литературе о, этот метод использует только два ингредиенты для индукции адипогенном CD34 + CD31 + клеток: агонист PPARγ — Росиглитазон — и человеческого инсулина. Важно отметить, что количество инсулина используются попадает в диапазон нормальный/высокий циркулирующих post-absorptive инсулина в людях14. Степень реагирования на инсулин клетки в пробирке, измеряется Akt фосфорилирование, не коррелирует с их способность реагировать на индукции коктейль. Интересно, что используя этот индукции коктейль и экспериментальных условиях, смесь белый и бежевый/коричневый клетки были получены как определяется размер и количество внутриклеточной липидного капель и проявление молекулярных маркеров. Этот простой и экономически индукции протокол наряду с количественной оценки фенотипа клетки ответчика (белый и бежевый) позволяет для скрининга агентов, которые потенциально могут изменить баланс дифференцированных бежевый : белый адипоцитов.
Этот метод также предоставляет поступательного подхода для понимания основных механизмов adipogenesis сосудистого эндотелия прародителей в жировых тканях человека. Используя эту технику конкретных изоляции/дифференциация, следователи могут допросить различных путей, ответственный за adipogenesis в подмножестве сосудистой эндотелиальных клеток от различных жировых отложений в худой и тучных людей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В центре внимания настоящего документа – обеспечить методологию для изоляции, расширения и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от висцеральных и подкожные депо жировых тканях человека.
Методологии были зарегистрированы для изоляции эндотелиальных кле?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Бекки Маркес, клинических координатором в центре Sentara лечение ожирения, для ее помощи с процессом скрининг и согласие пациента. Это исследование было поддержано R15HL114062 АНКА D. Dobrian.
Materials
|
Large Equipment |
|||
|
Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
|
Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
|
Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
|
RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
|
Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
|
Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
|
Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
|
ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
|
Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
|
Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
|
Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
|
Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
|
Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
|
KRBSS Buffer |
|||
|
HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
|
Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
|
Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
|
Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
|
Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
|
Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
|
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
|
Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
|
Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
|
Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
|
Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
|
Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
|
Tissue Digestion |
|||
|
20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
|
Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
|
Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
|
Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
|
Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
|
Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
|
Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
|
Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
|
Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
|
Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
|
Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
|
Cell Isolation |
|||
|
Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
|
Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
|
Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
|
Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
|
EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
|
Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
|
pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
|
pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
|
pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
|
pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
|
pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
|
Cell Culture |
|||
|
6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
|
4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
|
4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
|
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
|
Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
|
DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
|
Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
|
Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
|
Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
|
Cell Analysis |
|||
|
Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
|
96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
|
96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
|
RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
|
cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
|
JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
|
Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
|
dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
|
TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
|
TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
|
TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
|
TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
|
BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
|
Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
|
Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
|
TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
|
Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
|
Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
|
Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
|
EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
|
Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
|
Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
|
Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
|
Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
|
Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
|
Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
|
Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
|
37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
|
Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
|
DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
|
Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
|
Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
|
DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
Referências
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human ‘brite/beige’ adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance–mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
