Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo
Summary
La differenziazione degli adipociti bianchi e beige da progenitori vascolari del tessuto adiposo porta il potenziale di miglioramento metabolico nell’obesità. Descriviamo i protocolli per CD34 + CD31 + isolamento di cellule endoteliali da grasso umano e per una successiva in vitro espansione e differenziazione in adipociti bianchi e beige. Diverse applicazioni a valle sono discussi.
Abstract
L’obesità è accompagnata da un vasto rimodellamento del tessuto adiposo soprattutto via l’ipertrofia degli adipociti. Estremi del adipocyte crescita determina una scarsa risposta all’insulina, ipossia locale e l’infiammazione. Stimolando la differenziazione degli adipociti bianchi funzionale da progenitori, ipertrofia radicale della popolazione degli adipociti può essere prevenuta e, di conseguenza, la salute metabolica del tessuto adiposo può essere migliorata con una riduzione di infiammazione. Inoltre, stimolando una differenziazione degli adipociti beige/marrone, il dispendio energetico totale del corpo può essere aumentato, con conseguente perdita di peso. Questo approccio potrebbe prevenire lo sviluppo di comorbilità dell’obesità come diabete di tipo 2 e malattie cardiovascolari.
Questo articolo descrive l’isolamento, espansione e la differenziazione degli adipociti bianchi e beige da un sottoinsieme delle cellule endoteliali di tessuto adiposo umano che co-esprimono i marcatori CD31 e CD34. Il metodo è relativamente economico e non è alta intensità di lavoro. Richiede l’accesso al tessuto adiposo umano e il deposito sottocutaneo è adatto per il prelievo. Per questo protocollo, campioni di tessuto adiposo fresco da oggetti morboso obesi [indice di massa corporea (BMI) > 35] vengono raccolti durante le procedure di chirurgia bariatrica. Utilizzando un immunoseparation sequenziale dalla frazione vascolare stromal, abbastanza cellule sono prodotte da un minimo di 2 – 3 g di grassi. Queste cellule possono essere espanse in coltura oltre 10 – 14 giorni, possono essere crioconservate e mantengono le proprietà adipogenico con passaggio fino a passaggio 5 – 6. Le cellule sono trattate per 14 giorni con un adipogenico cocktail utilizzando una combinazione di insulina umana e l’agonista PPARγ-rosiglitazone.
Questa metodologia può essere utilizzata per l’ottenimento della prova degli esperimenti di concetto sui meccanismi molecolari che guidano le risposte adipogenico in cellule endoteliali adipose, o per lo screening di nuovi farmaci che possono migliorare l’adipogenico risposta diretta sia verso il bianco o differenziazione del adipocyte beige/marrone. Utilizzando piccole biopsie sottocutanee, questa metodologia utilizzabile per identificare i soggetti non responsivi per studi clinici voluti a stimolare adipociti bianchi e beige/marrone per il trattamento dell’obesità e co-morbidità.
Introduction
Dati recenti indicano che sia nei topi e nell’uomo, un sottoinsieme delle cellule che risiedono nel sistema vascolare del tessuto adiposo può essere differenziato nei adipocytes bianco o beige/marrone1,2,3. Il fenotipo di tali cellule è un argomento di polemica, con prove a sostegno di cellule endoteliali, muscolo liscio/pericyte o uno spettro di fenotipi intermedi4,5,6,7. L’ambito di sviluppo di questa metodologia è stato testare il potenziale adipogenico di CD34 + CD31 + cellule endoteliali isolate da diversi depositi di grasso da esseri umani obesi. Altri studi in letteratura si stanno concentrando sull’adipogenico potenziale della frazione vascolare stromal totale o del adipocyte noti progenitori2,8,9. Poiché le tecnologie attualmente esistenti possono indirizzare specificamente le cellule endoteliali del tessuto adiposo per droga consegna10, comprendere le potenzialità di tali cellule per subire adipogenico induzione verso adipocytes bianco o beige è importante per futuro di terapie mirate.
Diversi gruppi hanno riferito la combinazione di marcatori CD31 e CD34 come surrogati per isolare le cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano11,12,13. In genere, l’isolamento viene eseguita utilizzando due punti sequenziali e una selezione positiva utilizzando biglie magnetiche. In questo rapporto, è stato utilizzato immunoseparation utilizzando CD34 + biglie magnetiche combinati con perline in plastica CD31. Abbiamo trovato questa tecnica superiore alla immunoseparation magnetica sequenziale per quanto riguarda la conservazione della morfologia endoteliale tipico acciottolato. Inoltre, siamo stati in grado di generare abbastanza cellule necessarie per l’induzione di espansione e adipogenico a partire da un minimo di 1 – 2 g di grassi. Una biopsia di piccolo campione di grasso sottocutaneo è sufficiente per produrre la quantità necessaria di cellule per applicazioni a valle. Questo aspetto è potenzialmente importante, soprattutto se questo metodo sarà utilizzato per lo screening per una reattività ad induzione adipogenico nei soggetti umani.
A differenza di altri sistemi segnalati nella letteratura, questo metodo utilizza solo due ingredienti per l’induzione di adipogenico del CD34 + CD31 + cellule: un agonista PPARγ — rosiglitazone — e l’insulina umana. D’importanza, la quantità di insulina usata cade all’interno della gamma normale/alto di fare circolare l’insulina in esseri umani14. Il grado di reattività all’insulina del cellule in vitro, misurata dalla fosforilazione di Akt, non correla con la loro capacità di rispondere all’induzione cocktail. È interessante notare che, utilizzando questa condizioni di cocktail e sperimentale di induzione, un mix di bianche e beige/marrone cellule sono stati ottenuti come determinato dalle dimensioni e numeri di goccioline del lipido intracellulare e l’espressione di marcatori molecolari. Questo protocollo di induzione semplice e conveniente con la valutazione quantitativa del fenotipo delle cellule del radar-risponditore (bianco vs beige) permette uno screening degli agenti che potenzialmente possono alterare l’equilibrio del beige differenziato : bianco adipocytes.
Questo metodo fornisce anche un approccio traslazionale per comprendere i meccanismi di fondo del adipogenesis di progenitori endoteliali vascolari nel tessuto adiposo umano. Utilizzando questa tecnica di isolamento/differenziazione specifica, gli investigatori possono interrogare varie vie responsabili adipogenesis in un sottoinsieme delle cellule endoteliali vascolari da vari depositi di grasso in esseri umani magri ed obesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il focus di questo lavoro è quello di fornire una metodologia per l’isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali da depositi di viscerale e sottocutanei del tessuto adiposo umano.
Metodologie sono state segnalate per l’isolamento di cellule endoteliali da vari posti letto vascolare di roditori o di esseri umani che coinvolgono principalmente le tecniche utilizzando anticorpi CD31 fluorescente etichettati o accoppiato a biglie magnetiche…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere Becky Marquez, il coordinatore clinico presso il centro di Sentara bariatrica, per la sua assistenza con il processo del paziente di screening e consenzienti. Questa ricerca è stata sostenuta da R15HL114062 a Dobrian D. Anca.
Materials
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Large Equipment |
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Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
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|
Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
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|
Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
|
RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
|
Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
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|
Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
|
Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
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|
ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
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Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
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Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
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|
Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
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Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
|
Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
|
KRBSS Buffer |
|||
|
HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
|
Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
|
Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
|
Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
|
Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
|
Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
|
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
|
Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
|
Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
|
Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
|
Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
|
Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
|
Tissue Digestion |
|||
|
20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
|
Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
|
Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
|
Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
|
Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
|
Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
|
Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
|
Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
|
Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
|
Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
|
Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
|
Cell Isolation |
|||
|
Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
|
Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
|
Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
|
Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
|
EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
|
Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
|
pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
|
pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
|
pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
|
pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
|
pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
|
Cell Culture |
|||
|
6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
|
4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
|
4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
|
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
|
Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
|
DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
|
Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
|
Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
|
Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
|
Cell Analysis |
|||
|
Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
|
96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
|
96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
|
RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
|
cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
|
JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
|
Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
|
dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
|
TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
|
TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
|
TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
|
TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
|
BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
|
Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
|
Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
|
TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
|
Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
|
Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
|
Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
|
EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
|
Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
|
Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
|
Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
|
Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
|
Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
|
Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
|
Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
|
37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
|
Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
|
DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
|
Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
|
Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
|
DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
Referências
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human ‘brite/beige’ adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance–mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
