Summary

En fleksibel lavpris hydroponiske System til vurdering af plante svar til små molekyler i Sterile forhold

Published: August 25, 2018
doi:

Summary

En simpel, alsidig og billig in vitro- hydroponiske system var med held optimeret, aktivering storskalaforsøg under sterile forhold. Dette system letter anvendelsen af kemikalier i en løsning og deres effektive absorption af rødder for Molekylær, biokemiske og fysiologiske undersøgelser.

Abstract

En bred vifte af undersøgelser i Plantebiologi udføres ved hjælp af hydroponiske kulturer. I dette arbejde præsenteres en in vitro- hydroponiske vækst system designet til at vurdere plante svar til kemikalier og andre stoffer af interesse. Dette system er yderst effektive i at opnå homogen og sunde planter af C3 og C4 model arter Arabidopsis thaliana og Setaria viridis, henholdsvis. Steril dyrkning undgår alger og mikroorganisme forurening, som er kendt for begrænsende faktorer for planternes normale vækst og udvikling i hydroponics. Hertil kommer, er dette system skalerbar, aktivering høsten af plantemateriale i stor skala med mindre mekaniske skader, samt høst af enkelte dele af en plante, hvis det ønskes. En detaljeret protokol demonstrerer, at dette system har en nem og billig forsamling, som det anvender pipette stativer som den vigtigste platform for dyrkning af planter, er fastsat. Muligheden for dette system blev valideret ved hjælp af Arabidopsis stiklinger til at vurdere effekten af lægemidlet AZD-8055, en kemisk hæmmer til målet på rapamycin (TOR) kinase. TOR hæmning var effektivt opdaget så tidligt som 30 min efter en AZD-8055 behandling i rødder og skud. Desuden vises AZD-8055-behandlede planter den forventede stivelse-overskydende fænotype. Vi foreslog dette hydroponiske system som en ideel metode til plante forskere med det formål at overvåge virkningen af plante induktorer eller hæmmere, samt at vurdere metaboliske strømme ved hjælp af isotop-mærkning forbindelser, som generelt kræver brugen af dyre reagenser.

Introduction

Fordele af voksende planter ved hjælp af hydroponics har været bredt anerkendt i produktion af store og ensartede planter, giver reproducerbare eksperimenter1,2,3. I dette system, kan sammensætningen af den ernæringsmæssige løsning være ordentligt kontrolleret og genanvendt langs alle stadier af planternes vækst og udvikling. Derudover udsættes rødderne ikke for abiotiske understreger, som kan ske i jord-dyrkede planter, såsom næringsstof sult og vand mangel4. Som planter dyrkes hydroponically nuværende morfologiske og fysiologiske træk nogenlunde svarende til de dyrkes i jord, er dette system blevet bredt ansat i forskning fordi det giver mulighed for overvågning af root/skyde vækst og deres høst uden skader2,5.

På grund af muligheden for at ændre sammensætning og koncentration af de næringssalte løsning, de fleste af forskningen ved hjælp af hydroponiske betingelser er blevet udført for at karakterisere funktionerne af mikro- og makronæringsstoffer1,3 ,6,7,8. Men dette system har vist sig for at være meget nyttigt for en bred vifte af applikationer i Plantebiologi, såsom at belyse funktionerne af hormoner, og kemikalier i planter. For eksempel, opdagelsen af strigolactones som en ny klasse af hormoner9 og accelereret vækst fænotype udløst af brassinosteroid ansøgning10 blev udført på hydroponiske betingelser. Desuden, dette system giver mulighed for eksperimenter med mærket isotoper (f.eks., 14N /15Nielsen og 13CO2)11,12 at evaluere deres inkorporering i proteiner og metabolitter ved massespektrometri.

I betragtning af betydningen af dette system i planteforskning, et stort antal af hydroponiske kulturer er designet i de sidste par år, herunder systemer, der bruger (i) overføringen af stiklinger fra plader til hydroponiske containere3, 13; (ii) rockwool, der begrænser adgangen til de tidlige stadier af roden udvikling2,14,15; (iii) polyethylen granulat som flydende kroppen, hvilket gør en ensartet gennemførelse af små molekyler/behandlinger vanskeligt16; eller (iv) et reduceret antal planter9,17. Mængden af hydroponiske tanke beskrevet i mange af disse protokoller er normalt store (små mængder spænder fra 1-5 L, op til 32 L)18, som gør anvendelse af kemikalier ekstremt dyre. Selvom nogle undersøgelser beskrive en hydroponiske dyrkning under aseptiske forhold8,er19, samling af systemet normalt ganske besværligt, bestående af den perfekte tilpasning af nylon masker i plast eller glas containere5,8,17,20.

På grund af betydningen af Arabidopsis thaliana som en model plante, er størstedelen af hydroponics systemer designet til denne arter1,2,8,14,18, 19 , 20. ikke desto mindre, der er et par undersøgelser rapporteringsfunktioner hydroponiske vækst af andre plantearter med en forbehandling af frø til at forbedre deres spireevne og synkronisering satser in vitro-8,16 . For at arbejde på en stor skala, udviklede vi en protokol til at oprette en enkel og billig vedligeholdelse hydroponiske system, der gør det muligt for sterile forhold til dyrkning af planter, herunder A. thaliana og andre arter, såsom græs Setaria viridis. Metoden beskrevet her er velegnet til forskellige eksperimenter, som sætteplante vækst kan maksimeres, synkroniseret og nemt overvåges. Desuden, dette system har mange fordele som: (i) sin forsamling er ligetil og dets komponenter kan genbruges; (ii) det giver mulighed for nem anvendelse af forskellige kemikalier i det flydende miljoe; (iii) frøplanter spire og vokse direkte i dyrkningsmediet uden brug af overføringen til hydroponics system; (iv) skyde og root udvikling/vækst kan blive nøje overvåget og planter er høstet uden skader; og (v), det gør det muligt at arbejde på en stor skala, fastholde fysiologiske tilstande.

Protocol

1. forberedelse af flydende og fast kultur medier Forberede en flydende medium med halv styrke Murashige og Skoog (MS) medium med vitaminer [0.0125 mg/L af cobalt(II) chlorid pentahydrat, 0.0125 mg/L af copper(II) sulfat pentahydrat, 18.35 mg/L af ethylendiamintetraacetat jern natrium, 3.10 mg/L borsyre, 0.415 mg/L af kaliumiodid, 8.45 mg/L af mangan sulfat monohydrat, 0,125 mg/L af natrium molybdat dihydrat, 4,30 mg/L af zinksulfat en, 166.01 mg/L af calciumchlorid, 85 mg/L af kalium dihydrogen fosfat, 950 mg/…

Representative Results

TOR kinase er en væsentlig regulator, der integrerer næringsstoffer og energi signalering fremme celledelingen og vækst i alle eukaryoter. Bestræbelser på at belyse TOR funktioner i planter omfatter generation af Arabidopsis transgene linjer, der indeholder TOR betinget undertrykkelse gennem RNA-interferens eller kunstige mikroRNA28,30,31, givet embryo dødbringende Fænotypen af TO…

Discussion

Denne optimerede hydroponiske struktur gør det muligt for vellykket i vitro kultur af planter. Frøene spire godt på den solide medium på pipette tip flad overflade, en betydelig gevinst i forhold til systemer, hvor frø er gennemblødt med naeringsoploesningen. En stor fordel ved dette system er, at under udvikling sætteplante rødder får direkte kontakt med den flydende medium uden brug af overføringen. Derudover kan kemisk behandling let anvendes i Lage i en reduceret mængde. Luftfugtighed holdes højt…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af São Paulo Research Foundation (FAPESP; Giv 12/19561-0) og Max Planck Society. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), og Viviane C. H. da Silva (KAPPER/CNPEM 24/2013) er taknemmelig for stipendiaterne. Forfatterne takke Christian Meyer fra Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles i Frankrig) for generøst at give antistoffer mod RPS6. Forfatterne takke RTV UNICAMP og Ed Paulo Aparecido de Souza Manoel for deres tekniske support under audio optagelse.

Materials

Ethanol Merck 100983
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044
Polysorbate 20   Sigma-Aldrich P2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins  Duchefa Biochemie M0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate Duchefa Biochemie M1503
Agar  Sigma-Aldrich A7921
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 484016
Laminar flow hood Telstar BH-100
Hotplate AREC F20510011
Growth chamber Weiss Technik HGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm) Uniglass 189.006
200 μL pipette tip racks  Kasvi K8-200-5 *
300 μL multichannel pipette Eppendorf 3122000060
300 μL pipette tips Eppendorf 30073088
200 μL pipette  Eppendorf 3120000054
200 μL pipette tips Eppendorf 30000870
Scissors Tramontina 25912/108
Tweezer ABC Instrumentos 702915
Scalpel blade Sigma-Aldrich S2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m) Scotch 3M 5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H) Maxipac 32771

Referências

  1. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9, 4 (2013).
  2. Gibeaut, D. M., Hulett, J., Cramer, G. R., Seemann, J. R. Maximal Biomass of Arabidopsis thaliana Using a Simple, Low-Maintenance Hydroponic Method and Favorable Environmental Conditions. Plant Physiology. 115, 317-319 (1997).
  3. Nguyen, N. T., McInturf, S. A., Mendoza-Cózatl, D. G. Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements. Journal of Visualized Experiments. (113), e54317 (2016).
  4. Koevoets, I. T., Venema, J. H., Elzenga, J. T. M., Testerink, C. Roots Withstanding their Environment: Exploiting Root System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve Crop Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7, 1335 (2016).
  5. Arteca, R. N., Arteca, J. M. A novel method for growing Arabidopsis thaliana plants hydroponically. Physiologia Plantarum. 108, 188-193 (2000).
  6. Wang, R., Okamoto, M., Xing, X., Crawford, N. M. Microarray analysis of the nitrate response in Arabidopsis roots and shoots reveals over 1,000 rapidly responding genes and new linkages to glucose, trehalose-6-phosphate, iron, and sulfate metabolism. Plant Physiology. 132, 556-567 (2003).
  7. Hirai, M. Y., et al. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10205-10210 (2004).
  8. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biology. 14, 69 (2014).
  9. Umehara, M., et al. Inhibition of shoot branching by new terpenoid plant hormones. Nature. 455, 195-200 (2008).
  10. Arteca, J. M., Arteca, R. N. Brassinosteroid-induced exaggerated growth in hydroponically grown Arabidopsis plants. Physiologia Plantarum. 112, 104-112 (2001).
  11. Bindschedler, L. V., Palmblad, M., Cramer, R. Hydroponic isotope labelling of entire plants (HILEP) for quantitative plant proteomics; an oxidative stress case study. Phytochemistry. 69, 1962-1972 (2008).
  12. Huege, J., et al. GC-EI-TOF-MS analysis of in vivo carbon-partitioning into soluble metabolite pools of higher plants by monitoring isotope dilution after 13CO2 labelling. Phytochemistry. 68, 2258-2272 (2007).
  13. Berezin, I., Elazar, M., Gaash, R., Avramov-Mor, M., Shaul, O., Asao, T. The Use of Hydroponic Growth Systems to Study the Root and Shoot Ionome of Arabidopsis thaliana. Hydroponics: A Standard Methodology for Plant Biological Researches. , 135-152 (2012).
  14. Smeets, K., et al. Critical evaluation and statistical validation of a hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry. 46, 212-218 (2008).
  15. Huttner, D., Bar-zvi, D. An improved, simple, hydroponic method for growing Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 59-63 (2003).
  16. Battke, F., Schramel, P., Ernst, D. A novel method for in vitro culture of plants: Cultivation of barley in a floating hydroponic system. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 405-409 (2003).
  17. Negi, M., Sanagala, R., Rai, V., Jain, A. Deciphering Phosphate Deficiency-Mediated Temporal Effects on Different Root Traits in Rice Grown in a Modified Hydroponic System. Frontiers in Plant Science. 7, 550 (2016).
  18. Tocquin, P., et al. A novel high efficiency, low maintenance, hydroponic system for synchronous growth and flowering of Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biology. 3, 2 (2003).
  19. Schlesier, B., Bréton, F., Mock, H. P. A hydroponic culture system for growing Arabidopsis thaliana plantlets under sterile conditions. Plant Molecular Biology Reporter. 21, 449-456 (2003).
  20. Norén, H., Svensson, P., Andersson, B. A convenient and versatile hydroponic cultivation system for Arabidopsis thaliana. Physiologia Plantarum. 121, 343-348 (2004).
  21. Martins, P. K., Ribeiro, A. P., da Cunha, B. A. D. B., Kobayashi, A. K., Molinari, H. B. C. A simple and highly efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol for Setaria viridis. Biotechnology Reports. 6, 41-44 (2015).
  22. Montané, M. H., Menand, B. ATP-competitive mTOR kinase inhibitors delay plant growth by triggering early differentiation of meristematic cells but no developmental patterning change. Journal of Experimental Botany. 64, 4361-4374 (2013).
  23. Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell. 13, 1499-1510 (2001).
  24. Dobrenel, T., et al. The Arabidopsis TOR Kinase Specifically Regulates the Expression of Nuclear Genes Coding for Plastidic. Frontiers in Plant Science. 7, 1611 (2016).
  25. Lunn, J. E., Furbank, R. T. Localisation of sucrose-phosphate synthase and starch in leaves of C4 plants. Planta. 202, 106-111 (1997).
  26. Hendriks, J. H. M., Kolbe, A., Gibon, Y., Stitt, M., Geigenberger, P. ADP-Glucose Pyrophosphorylase Is Activated by Posttranslational Redox-Modification in Response to Light and to Sugars in Leaves of Arabidopsis and Other Plant Species. Plant Physiology. 133, 838-849 (2003).
  27. Stitt, M., Lilley, R. M., Gerhardt, R., Heldt, H. W., Fleischer, S., Fleischer, B. Metabolite levels in specific cells and subcellular compartments of plant leaves. Methods in Enzymology. 174, 518-552 (1989).
  28. Caldana, C., et al. Systemic analysis of inducible target of rapamycin mutants reveal a general metabolic switch controlling growth in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 73, 897-909 (2013).
  29. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  30. Dobrenel, T., et al. Sugar metabolism and the plant target of rapamycin kinase: a sweet operaTOR?. Frontiers in Plant Science. 4, 93 (2013).
  31. Moreau, M., et al. Mutations in the Arabidopsis homolog of LST8/GβL, a partner of the target of Rapamycin kinase, impair plant growth, flowering, and metabolic adaptation to long days. The Plant Cell. 24, 463-481 (2012).
  32. Deprost, D., et al. The Arabidopsis TOR kinase links plant growth, yield, stress resistance and mRNA translation. EMBO Reports. 8, 864-870 (2007).
  33. Menand, B., et al. Expression and disruption of the Arabidopsis TOR (target of rapamycin) gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6422-6427 (2002).
  34. Mahfouz, M. M., Kim, S., Delauney, A. J., Verma, D. P. Arabidopsis TARGET OF RAPAMYCIN Interacts with RAPTOR, Which Regulates the Activity of S6 Kinase in Response to Osmotic Stress Signals. The Plant Cell. 18, 477-490 (2006).
  35. Zhang, R., et al. ScFKBP12 bridges rapamycin and AtTOR in Arabidopsis. Plant Signaling & Behavior. 8, e26115 (2013).
  36. Schepetilnikov, M., et al. TOR and S6K1 promote translation reinitiation of uORF-containing mRNAs via phosphorylation of eIF3h. The EMBO Journal. 32, 1087-1102 (2013).
  37. Schepetilnikov, M., et al. Viral factor TAV recruits TOR/S6K1 signalling to activate reinitiation after long ORF translation. The EMBO Journal. 30, 1343-1356 (2011).
  38. Xiong, Y., et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems. Nature. 496, 181-186 (2013).
  39. Creff, A., Sormani, R., Desnos, T. The two Arabidopsis RPS6 genes, encoding for cytoplasmic ribosomal proteins S6, are functionally equivalent. Plant Molecular Biology. 73, 533-546 (2010).
  40. Turck, F., Zilbermann, F., Kozma, S. C., Thomas, G., Nagy, F. Phytohormones participate in an S6 kinase signal transduction pathway in Arabidopsis. Plant Physiology. 134, 1527-1535 (2004).
  41. Gibon, Y., et al. Adjustment of diurnal starch turnover to short days: Depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbohydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the followin. Plant Journal. 39, 847-862 (2004).
  42. Smith, A. M., Stitt, M. Coordination of carbon supply and plant growth. Plant, Cell & Environment. 30, 1126-1149 (2007).
  43. Smith, A. M., Zeeman, S. C., Smith, S. M. Starch Degradation. Annual Review of Plant Biology. 56, 73-98 (2005).
  44. Orzechowski, S. Starch metabolism in leaves. Acta Biochimica Polonica. 55, 435-445 (2008).
  45. Gibon, Y., et al. Adjustment of growth, starch turnover, protein content and central metabolism to a decrease of the carbon supply when Arabidopsis is grown in very short photoperiods. Plant, Cell & Environment. 32 (7), 859-874 (2009).
  46. Kim, J. B., Kang, J. Y., Soo, Y. K. Over-expression of a transcription factor regulating ABA-responsive gene expression confers multiple stress tolerance. Plant Biotechnology Journal. 2, 459-466 (2004).
  47. Vishwakarma, K., et al. Abscisic Acid Signaling and Abiotic Stress Tolerance in Plants: A Review on Current Knowledge and Future Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, 161 (2017).
  48. Yoshida, T., et al. Four Arabidopsis AREB/ABF transcription factors function predominantly in gene expression downstream of SnRK2 kinases in abscisic acid signalling in response to osmotic stress. Plant, Cell & Environment. 38, 35-49 (2015).
  49. Koch, K. E. Carbohydrate-Modulated Gene Expression in Plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
  50. Price, J., Laxmi, A., St Martin, S. K., Jang, J. C. Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. The Plant Cell. 16, 2128-2150 (2004).
  51. Thimm, O., et al. mapman: a user-driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes. The Plant Journal. 37, 914-939 (2004).
  52. Bläsing, O. E., et al. Sugars and Circadian Regulation Make Major Contributions to the Global Regulation of Diurnal Gene Expression in Arabidopsis. The Plant Cell. 17, 3257-3281 (2005).
  53. Osuna, D., et al. Temporal responses of transcripts, enzyme activities and metabolites after adding sucrose to carbon-deprived Arabidopsis seedlings. The Plant Journal. 49, 463-491 (2007).
  54. Yadav, U. P., et al. The sucrose-trehalose 6-phosphate (Tre6P) nexus: specificity and mechanisms of sucrose signalling by Tre6P. Journal of Experimental Botany. 65, 1051-1068 (2014).
  55. Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: A Model for C4 Photosynthesis. The Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
  56. Altman, N., Krzywinski, M. Points of Significance: Clustering. Nature Methods. 14, 545-546 (2017).
  57. Pratelli, R., Boyd, S., Pilot, G. Analysis of amino acid uptake and translocation in Arabidopsis with a low-cost hydroponic system. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 179, 286-293 (2016).
check_url/pt/57800?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Monte-Bello, C. C., Araujo, E. F., Martins, M. C., Mafra, V., da Silva, V. C., Celente, V., Caldana, C. A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions. J. Vis. Exp. (138), e57800, doi:10.3791/57800 (2018).

View Video