Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için
Summary
Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.
Abstract
Özel hücreler pluripotent kök hücrelerinin üretimini rejeneratif tıp için yeni yaklaşımlar geliştirmek için güçlü bir araç sağlar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) nerede Retina hücre IPSC kaynaklı modelleri anlamak ve körlük mücadele için önemli bir adım ileri işaretlemek Retina dystrophies, nörodejeneratif hastalık çalışmaları için özellikle çekici kullanmaktır. Bu yazıda, biz oluşturmak, Olgun ve Retina organoids cryopreserve için basit ve ölçeklenebilir iletişim kuralı tanımlamak. Orta değiştirilmesi hakkında temel, bu yöntemin ana avantajı birden fazla önlemek için ve zaman alıcı adımları yaygın olarak iPSCs bir rehberli farklılaşma içinde gerekli. Retina gelişme erken aşamalarında başarılı değişiklikleri yapisan insan IPSC kültürler üzerinde tanımlanan medya tarafından taklit eden, bu iletişim kuralları, neuroretinal yapıları ve Retina pigmentli epitel (RPE) hücreleri kendi kendini oluşturan eşzamanlı üretimi sağlar bir 4 hafta tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde. Retina progenitör hücre (RPC’ler) içeren bu yapılar için daha fazla olgunlaşma RPC farklılaşmaya yetişkin insan retinada mevcut yedi Retina hücre türlerine izin kayan bir kültür durumda kolayca ayrılmış olabilir. Ayrıca, Retina organoids dondurma için hızlı yöntemleri ve RPE hücrelerinin uzun süreli depolama için açıklar. Birlikte birlikte, burada açıklanan yöntemleri üretmek ve insan IPSC kaynaklı Retina hücreleri veya doku temel ve klinik araştırma için banka yararlı olacaktır.
Introduction
Retina Merkezi sinir sistemi (MSS) ayrılmaz bir parçasıdır ve travmatik bir yaralanma veya hastalık kendiliğinden yeniden oluşturmak için sınırlı bir kapasiteye sahip. Bu nedenle, dejeneratif patolojiler kesin Retina hücre kaybı, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), retinitis pigmentosa (RP), glokom ve diyabetik retinopati, gibi neden genellikle geri dönüşü olmayan körlük neden. Dejenere retina tahlisiye kök hücre tabanlı terapiler bozuk veya eksik hücrelerin yerini alır amaçlayan en umut verici yaklaşımlar1,2,3biri olan büyük bir sorun olduğunu. Pluripotent kök hücreler insan embriyonik kök hücreleri (ESCs) hücreler olarak veya insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) kültürü süresiz olarak genişletilecek kapasitesine sahip ve herhangi bir hücre tipleri üretmek potansiyeline sahip. Vitro geliştirilmesi ve Retina geliştirme anlayışımızı gelişmeler protokolleri insan IPSC farklılaşma sonuçlandı için Retina organoids7,8,9üretimi, 10,11,12. Retina ganglion hücrelerinin (RGCs), photoreceptors ve Retina pigmentli epitel (RPE) hücreleri, dahil olmak üzere büyük Retina hücreleri başarıyla insan ESCs ve iPSCs4,5dan, Ayrıştırılan 6. Eiraku vd tarafından geliştirilen SFEB (serum serbest kültür embryoid vücut benzeri toplamları) yöntemine dayalı 13, Retina organoids öz oluşumu ESC veya IPSC türetilmiş tanımlı hücre dışı matriks bileşenlerinin7,10,14embryoid vücut benzeri toplamları üzerinden elde edilebilir. Ama bu tedavi yaklaşımları veya uyuşturucu tarama için adımları değil her zaman hücreler büyük üretim ile uyumlu çok sayıda gerektiren karmaşık iletişim kurallarıdır. Böylece, insan Retina hücreleri üretmek için yöntem seçiminde önemlidir ve Yöntem sağlam, ölçeklenebilir ve etkin olması gerekir.
Burada, bizim önceki yayın15tarihinde dayanarak, biz her adım bir besleyici ve xeno özgür durumda ekili yapisan insan iPSCs üzerinden Retina organoid öz oluşumu ile retina hücreleri basit ve etkili bir nesil için açıklamak. Yapisan insan iPSCs rutin kültürleri başlayarak, bu iletişim kuralı yalnızca basit bir ardışık orta IP’leri türetilmiş RPE (hiRPE) hücreleri ve neuroretinal yapıları nesil 4 hafta içinde izin vermek için değiştirme gerektirir. El ile bir yalıtım sonra hiRPE-ebilmek var olmak genişlemek ve Retina yapıları Retina progenitör hücre içine tüm Retina hücre tipleri sıralı vivo insan ile tutarlı ayırt etmek mümkün nerede organoids yüzen olarak kültürlü retinogenesis. Son olarak, araştırma gelişme veya klinik çeviri için biz onların fenotipik özellikleri ve işlevselliği etkilemeden bütün Retina organoids ve hiRPE hücreleri uzun süreli depolama sağlayan bir dondurma yöntemi açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı RPE hücrelerinin ve Retina organoids, Retina RGCs ve photoreceptors, xeno ve besleyici özgür koşullarda insan pluripotent kök hücrelerden içeren üretmek nasıl açıklar. Burada sunulan uyumlu iyi üretim uygulaması (GMP) süreci, ekili yöntemi ile retina hücreleri IPSC kaynaklı büyük bir üretim RPE hücrelerinin, RGCs ve photoreceptors kök hücre tabanlı terapiler ve ilaç geliştirilmesi için izin verir. keşif için Retina Dejeneratif hastalıkları tedavi gelecekte yaklaşıyor….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kendi giriş için Goureau’nın ekibinin sırasında belgili tanımlık yöntem tanımlamak burada ve G. Gagliardi ve M. Garita up kendi eleştirel okuma için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser ANR gelen hibe tarafından desteklenmiştir (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), Retina Fransa Derneği ve teknoloji transferi şirket SATT Lutech. Ayrıca Investissements d’Avenir programı (ANR-11-IDEX-0004-02) içinde ANR tarafından desteklenen LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) çerçevesinde gerçekleştirildi.
Materials
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
Referências
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
- Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
- Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
- Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
- Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
- Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
- Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
- Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).
