Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno
Summary
La produzione di cellule specializzate della retina da cellule staminali pluripotenti è un punto di svolta nello sviluppo della terapia a base di cellule staminali per malattie retiniche. Il presente documento descrive un metodo semplice per una generazione efficiente dei organoids della retina e dell’epitelio pigmentato retinico per la ricerca di base, traslazionale e clinica.
Abstract
La produzione di cellule specializzate da cellule staminali pluripotenti fornisce un potente strumento per sviluppare nuovi approcci per la medicina rigenerativa. L’uso di cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSCs) è particolarmente interessante per gli studi di malattie neurodegenerative, tra cui distrofie retiniche, dove modelli iPSC-derivato delle cellule retiniche segnano un importante passo avanti per capire e combattere la cecità. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice e scalabile per generare, maturo e crioconservare organoids retinica. Basate sul cambiamento medio, il vantaggio principale di questo metodo è quello di evitare più e passaggi che richiede tempo comunemente richiesti in una differenziazione guidata delle iPSCs. Imitando le prime fasi di sviluppo retinico da successive modifiche dei media definiti sulle culture aderente iPSC umana, questo protocollo permette la generazione simultanea di self-formando strutture di neuroretinal e le cellule epiteliali pigmentate della retina (RPE) in un in modo riproducibile ed efficiente in 4 settimane. Queste strutture contenenti cellule progenitrici retinica (RPC) possono essere facilmente isolate di ulteriore maturazione in una condizione di cultura galleggiante che permette la differenziazione di RPC in sette tipi retinica delle cellule presenti nella retina umana adulta. Inoltre, vengono descritti metodi rapidi per la crioconservazione dei organoids retinica e cellule RPE per immagazzinaggio a lungo termine. Combinati insieme, i metodi descritti qui sarà utili per produrre e Banca iPSC-derivato della retina cellule o tessuti umani per la ricerca clinica e di base.
Introduction
La retina è parte integrante del sistema nervoso centrale (SNC) e ha una capacità limitata di rigenerarsi spontaneamente a seguito di una lesione traumatica o malattie. Di conseguenza, patologie degenerative, causando la perdita definitiva delle cellule della retina, come la degenerazione maculare senile (AMD), retinite pigmentosa (RP), il glaucoma e la retinopatia diabetica, in genere portano a cecità irreversibile. Salvataggio della retina degenerata è una sfida importante per i quali terapie basate sulle cellule staminali che mira a sostituire le cellule danneggiate o perse sono uno dei più promettenti approcci1,2,3. Cellule staminali pluripotenti come cellule staminali embrionali umane (CES) o cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSCs) hanno la capacità di essere espansa all’infinito nella cultura, e hanno il potenziale per produrre qualsiasi tipo di cellula. Progressi nella nostra comprensione dello sviluppo della retina e il miglioramento in vitro di protocolli per differenziazione umana iPSC hanno provocato la generazione di organoids retinica7,8,9, 10,11,12. Tutte le principali cellule della retina, incluse le cellule retiniche del ganglio (RGCs) fotorecettori e cellule epiteliali pigmentate retiniche di (RPE), sono state correttamente differenziate dai umano CES e iPSCs4,5, 6. sulla base del metodo SFEB (coltura privo di siero di embryoid corpo-come aggregati) sviluppato da Eiraku et al. 13, autoformazione dei organoids retinica sono ottenibili da ESC – o iPSC-derivati embryoid corpo-come aggregati nella matrice extracellulare definiti componenti7,10,14. Ma questi protocolli sono complessi, che richiedono un numero elevato di passaggi non sempre compatibili con la grande produzione di cellule per approcci terapeutici o lo screening di stupefacenti. Così, la scelta del metodo per la produzione di cellule della retina umane è fondamentale e il metodo deve essere robusta, scalabile ed efficiente.
Qui, sulla nostra precedente pubblicazione15, descriviamo ogni passo per una generazione semplice ed efficiente di cellule retiniche attraverso autoformazione organoid retinico da aderente iPSCs umane coltivate in una condizione di alimentatore e xeno-free. A partire da colture sistematiche di aderente iPSCs umane, questo protocollo richiede solo un semplice mezzo successivo cambiando per consentire la generazione di cellule iPS-derivate di RPE (hiRPE) e di neuroretinal strutture in 4 settimane. Dopo un isolamento manuale, hiRPE può essere espansa e strutture retiniche possono essere coltivate come galleggiante organoids dove le cellule progenitrici della retina sono in grado di differenziarsi in tutti i tipi di cellule retiniche in un ordine sequenziale coerenza con l’essere umano in vivo retinogenesis. Infine, per avanzamento di ricerca o traduzione clinica, descriviamo un metodo di crioconservazione consentendo l’archiviazione a lungo termine dei organoids intero retinica e hiRPE delle cellule senza influire sulle loro caratteristiche fenotipiche e funzionalità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive come produrre cellule RPE e organoids retinica, contenente RGCs retinico e fotorecettori, da cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di xeno e alimentatore-free. Compatibile con il processo di buona fabbricazione (GMP), il metodo coltivato qui presentato permette un’ampia produzione di cellule retiniche iPSC-derivati come cellule RPE, RGCs e fotorecettori per lo sviluppo di terapie basate sulle cellule staminali e droga individuazione di approcci per il trattamento futuro di malattie…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare i membri del team di Goureau per il loro contributo durante la messa a punto dei metodi descritti qui e G. Gagliardi e M. Garita per loro lettura critica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da ANR (GPiPS: RFCS005-2010-ANR; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), la Retina France Association e la tecnologia di trasferimento azienda Lutech SATT. Inoltre è stata effettuata nell’ambito della LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) supportato da ANR all’interno del programma di Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0004-02).
Materials
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
Referências
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
- Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
- Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
- Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
- Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
- Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
- Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
- Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).
