परिभाषित एक्सो-नि: शुल्क और फीडर-मानव iPSC की पीढ़ी के लिए मुक्त संस्कृति शर्तों-व्युत्पन्न रेटिना सेल मॉडल
Summary
pluripotent स्टेम सेल से विशेष रेटिना कोशिकाओं का उत्पादन रेटिना रोगों के लिए स्टेम कोशिका आधारित चिकित्सा के विकास में एक मोड़ है. वर्तमान कागज बुनियादी, शोधों, और नैदानिक अनुसंधान के लिए रेटिना organoids और रेटिना pigmented उपकला की एक कुशल पीढ़ी के लिए एक सरल तरीका का वर्णन.
Abstract
pluripotent स्टेम कोशिकाओं से विशेष कोशिकाओं के उत्पादन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है अपक्षयी चिकित्सा के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करना । मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) का उपयोग विशेष रूप से neurodegenerative रोग के अध्ययन के लिए आकर्षक है, रेटिना dystrophies सहित, जहां iPSC व्युत्पन्न रेटिना सेल मॉडल एक प्रमुख कदम आगे समझने के लिए और अंधापन से लड़ने के लिए चिह्नित. इस पत्र में, हम एक सरल और स्केलेबल प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए उत्पंन, परिपक्व, और cryopreserve रेटिना organoids । मध्यम बदलने के आधार पर, इस विधि का मुख्य लाभ सामांयतः iPSCs के एक निर्देशित भेदभाव में आवश्यक कई और समय लेने वाली कदम से बचने के लिए है । अनुयाई मानव iPSC संस्कृतियों पर परिभाषित मीडिया के क्रमिक परिवर्तन द्वारा रेटिना विकास के प्रारंभिक चरणों नकल उतार, इस प्रोटोकॉल एक में स्व-बनाने neuroretinal संरचनाओं और रेटिना pigmented उपकला (RPE) कोशिकाओं के एक साथ पीढ़ी की अनुमति देता है reproducible और कुशल तरीके से 4 हफ्तों में । इन संरचनाओं रेटिना जनक कोशिकाओं (rpc) युक्त एक अस्थायी संस्कृति हालत में सात रेटिना कोशिका वयस्क मानव रेटिना में मौजूद प्रकार में rpc के भेदभाव को सक्षम करने में आगे परिपक्वता के लिए आसानी से अलग किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, हम लंबी अवधि के भंडारण के लिए रेटिना organoids और RPE कोशिकाओं के cryopreservation के लिए त्वरित तरीकों का वर्णन । एक साथ संयुक्त, यहां वर्णित तरीकों का उत्पादन और बैंक मानव iPSC-व्युत्पन्न रेटिना कोशिकाओं या दोनों बुनियादी और नैदानिक अनुसंधान के लिए ऊतक के लिए उपयोगी हो जाएगा ।
Introduction
रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का एक अभिन्न हिस्सा है और एक दर्दनाक चोट या रोगों के बाद अनायास पुनर्जीवित करने के लिए एक सीमित क्षमता है. इसलिए, अपक्षयी इस तरह की उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन (AMD), रेटनाइटिस pigmentosa (आरपी), मोतियाबिंद, और मधुमेह रेटिनोपैथी के रूप में निश्चित रेटिना कोशिका हानि, पैदा आमतौर पर अपरिवर्तनीय अंधापन के लिए सीसा । पतित रेटिना बचाव एक प्रमुख चुनौती है जिसके लिए कोशिका को क्षतिग्रस्त या खो कोशिकाओं को बदलने के लिए लक्ष्य आधारित उपचार के लिए एक सबसे होनहार दृष्टिकोण में से एक है1,2,3। Pluripotent मानव भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) कोशिकाओं या मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) के रूप में स्टेम सेल संस्कृति में अनिश्चित काल तक विस्तारित करने की क्षमता है, और वे किसी भी कोशिका प्रकार के उत्पादन की क्षमता है । रेटिना विकास और मानव iPSC भेदभाव के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल में सुधार की हमारी समझ में अग्रिमों रेटिना organoids की पीढ़ी में हुई है7,8,9, 10,11,12. रेटिना नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं (RGCs), photoreceptors, और रेटिना pigmented उपकला (RPE) कोशिकाओं सहित प्रमुख रेटिना कोशिकाओं, के सभी, मानव ESCs और iPSCs से सफलतापूर्वक विभेदित किया गया है4,5, 6. Eiraku एट अल द्वारा विकसित SFEB (सीरम मुक्त संस्कृति के embryoid शरीर की तरह समुच्चय) विधि पर आधारित है । 13, रेटिना organoids के स्व-गठन ESC से प्राप्त किया जा सकता है-या iPSC-व्युत्पंन embryoid शरीर की तरह समुच्चय में परिभाषित extracellular मैट्रिक्स घटकों7,10,14। लेकिन इन प्रोटोकॉल जटिल, चिकित्सकीय दृष्टिकोण या दवा स्क्रीनिंग के लिए कोशिकाओं के बड़े उत्पादन के साथ हमेशा संगत नहीं कदम की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है । इस प्रकार, मानव रेटिना कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए विधि का चुनाव महत्वपूर्ण है और विधि मजबूत, स्केलेबल, और कुशल होने की जरूरत है.
यहां, हमारे पिछले प्रकाशन15के आधार पर, हम रेटिना organoid के माध्यम से रेटिना कोशिकाओं के एक सरल और कुशल पीढ़ी के लिए प्रत्येक कदम का वर्णन अनुयाई मानव iPSCs से एक फीडर से मुक्त और एक्सो मुक्त हालत में खेती की । अनुयाई मानव iPSCs की दिनचर्या संस्कृतियों से शुरू, इस प्रोटोकॉल केवल एक साधारण उत्तराधिकारी के लिए दोनों आईपीएस की पीढ़ी की अनुमति बदलने के माध्यम से RPE (hiRPE) कोशिकाओं और 4 हफ्तों में neuroretinal संरचनाओं व्युत्पंन की आवश्यकता है । एक मैनुअल अलगाव के बाद, hiRPE विस्तार किया जा सकता है और रेटिना संरचनाओं के रूप में अस्थायी organoids जहां रेटिना जनक कोशिकाओं में सभी रेटिना सेल प्रकार में एक क्रमिक क्रम में अंतर करने में सक्षम हैं के रूप में प्रसंस्कृत किया जा सकता vivo मानव retinogenesis । अंत में, अनुसंधान उन्नति या नैदानिक अनुवाद के लिए, हम एक cryopreservation अपने phenotypic विशेषताओं और कार्यक्षमता को प्रभावित किए बिना पूरे रेटिना organoids और hiRPE कोशिकाओं के दीर्घकालिक भंडारण की अनुमति विधि का वर्णन.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे RPE कोशिकाओं और रेटिना organoids का उत्पादन करने के लिए, रेटिना RGCs और photoreceptors से युक्त, pluripotent में मानव एक्सो स्टेम कोशिकाओं से मुक्त और फीडर मुक्त शर्तों. अच्छी विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक की स्थापना के दौरान अपने इनपुट के लिए है Goureau टीम के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा यहां वर्णित तरीकों की, और उनके महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जी Gagliardi और एम. Garita । यह काम ANR (GPiPS: ANR-२०१०-RFCS005 से अनुदान द्वारा समर्थित था; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), रेटिना फ्रांस एसोसिएशन और प्रौद्योगिकी अंतरण कंपनी सत्त Lutech । यह भी ANR Investissements कार्यक्रम (d’Avenir-11-ANR-0004-02) के भीतर IDEX द्वारा समर्थित LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-६५) के फ्रेम में प्रदर्शन किया गया था ।
Materials
| Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
| CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
| Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
| Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
| CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
| N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
| CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
| Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
| Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| 24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
| 6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |
Referências
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -. A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
- Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
- Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2 (2014).
- Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
- Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
- Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
- Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
- Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
- Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
- Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).
