Produktionen af specialiserede retinale celler fra pluripotente stamceller er et vendepunkt i udviklingen af stamcelle-baseret terapi for retinal sygdomme. Den nuværende papir beskriver en simpel metode til en effektiv generation af retinale organoids og retinal pigmenteret epitel til grundlæggende, translationel og klinisk forskning.
Produktionen af specialiserede celler fra pluripotente stamceller giver et kraftfuldt værktøj til at udvikle nye tilgange til regenerativ medicin. Brug af human-induceret pluripotente stamceller (iPSCs) er særligt attraktive for neurodegenerativ sygdom undersøgelser, herunder retinal dystrophies, hvor iPSC-afledte retinal cell modeller markerer et stort skridt fremad til at forstå og bekæmpe blindhed. I dette papir beskriver vi en enkel og skalerbar protokol for at generere, modne og cryopreserve retinale organoids. Baseret på mellemlang skiftende, den største fordel ved denne metode er at undgå flere og tidskrævende trin kræves almindeligvis i en guidet differentiering af iPSCs. Efterligne de tidlige faser af retinal udvikling af successive ændringer af definerede medier på vedhængende menneskelige iPSC kulturer, denne protokol giver mulighed for den samtidige generation af selvstændige danner neuroretinal strukturer og retinal pigmenteret epitel (ÅV) celler i en reproducerbare og effektiv måde i 4 uger. Disse strukturer, som indeholder retinal stamceller (fjernprocedurekald (RPC)) kan være let isoleret til yderligere modning i et flydende kultur tilstand gør det muligt for differentiering af fjernprocedurekald (RPC) til de syv retinal celletyper i den voksne menneskelige nethinde. Derudover beskriver vi hurtig metoder for kryopræservering af retinale organoids og ÅV celler til langtidsopbevaring. Kombineret sammen, vil de metoder, der beskrives her være nyttigt at producere og bank iPSC-afledte retinale celler eller væv til både grundforskning og klinisk forskning.
Nethinden er en integreret del af det centrale nervesystem (CNS) og har en begrænset kapacitet til at regenerere spontant efter en traumatisk skade eller sygdomme. Derfor, degenerative sygdomme forårsager endelige retinal celletab, såsom aldersrelateret Macula degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP), glaukom og diabetisk retinopati, typisk føre til uoprettelige blindhed. Redning degenererede nethinden er en stor udfordring som stamcelle-baserede behandlinger har til formål at erstatte de beskadigede eller mistede celler er en af de mest lovende metoder1,2,3. Pluripotente stamceller som humane embryonale stamceller (økonomiske) celler eller menneskelige-induceret pluripotente stamceller (iPSCs) har kapacitet til at blive udvidet på ubestemt tid i kulturen, og de har potentiale til at producere alle celletyper. Fremskridt i vores forståelse af retinal udvikling og forbedring af in vitro- protokoller for menneskelige iPSC differentiering har resulteret i generation af retinale organoids7,8,9, 10,11,12. Alle de store retinale celler, herunder retinal ganglion celler (RGCs), fotoreceptorer, og retinal pigmenteret (ÅV) epitelceller, har med succes blevet differentieret fra menneskelige og sociale råd og iPSCs4,5, 6. baseret på SFEB (serum-fri kultur af embryoid krop-lignende aggregater) metode udviklet af Eiraku et al. 13, selvstændig dannelsen af retinale organoids kan fås fra ESC – eller iPSC-afledte embryoid krop-lignende aggregater i definerede ekstracellulære matrix komponenter7,10,14. Men disse protokollerne er indviklede, der kræver et stort antal trin ikke altid kompatible med den store produktion af celler til terapeutiske tilgange eller stof screening. Således, at valget af metoden til at producere menneskelige retinale celler er kritisk og metoden skal være robust, skalerbar og effektiv.
Her, beskriver baseret på vores tidligere publikation15, vi hvert trin i en enkel og effektiv generation af retinale celler via retinale organoid selvstændig dannelse fra vedhængende menneskelige iPSCs dyrkes i et feeder-fri og xeno tilstand. Startende fra rutinemæssige kulturer af vedhængende menneskelige iPSCs, kræver denne protokol kun en simpel successive medium forandring for at tillade generation af både iPS-afledte ÅV (hiRPE) celler og neuroretinal strukturer i 4 uger. Efter en manuel isolering, hiRPE kan udvides og de retinale strukturer kan blive kulturperler som flydende organoids hvor de retinale stamceller er i stand til at differentiere i alle retinal celletyper i sekventiel rækkefølge i overensstemmelse med i vivo menneskelige retinogenesis. Endelig, for forskning avancement eller kliniske oversættelse, vi beskriver en kryopræservering metode tillader langtidsopbevaring af hele retinale organoids og hiRPE celler uden at det påvirker deres fænotypiske egenskaber og funktionalitet.
Denne protokol beskriver hvordan man producerer ÅV celler og retinal organoids, som indeholder retinal RGCs og fotoreceptorer, fra humane pluripotente stamceller i xeno-fri og feeder-fri betingelser. Kompatibel med god fremstilling af praksis (GMP) proces, metoden dyrkede præsenteres her tillader en stor produktion af iPSC-afledte retinale celler som ÅV celler, RGCs og fotoreceptorer for udviklingen af stamceller-baserede behandlinger og medicin Discovery tilgange for den fremtidige behandling af retinale degenerative…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Goureau’s team for deres input under Opsætning af de metoder, der beskrives her, og G. Gagliardi og M. Garita for deres kritiske læsning. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), nethinden Frankrig Association og den teknologioverførsel selskab SATT Lutech. Det blev også udført inden for rammen af LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) understøttes af ANR inden for programmet Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0004-02).
Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A14700 | Coating |
CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated | ThermoFisher Scientific | A27940 | Coating |
Essential 8 Medium | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medium |
Essential 6 Medium | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medium |
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement | ThermoFisher Scientific | A1370701 | supplement CTS |
N-2 Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | supplement |
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | supplement |
CTS B-27 Supplement, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | supplement CTS |
DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medium |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | supplement |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiotic |
CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFisher Scientific | A1569601 | Matrix |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | dissociation solution |
Cryostem Freezing Media | clinisciences | 05-710-1D | Cryopreservation medium |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
AGANI needle 23G | Terumo | AN*2332R1 | Needle |
Flask 25 cm² Tissue Culture Treated | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
24 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3526 | 24-well plate |
6 well plate Tissue Culture Treated | Costar | 3516 | 6-well plate |