초파리 melanogaster 운동을 부드럽게 유도 위한 TreadWheel: 간격 훈련 프로토콜

1. TreadWheel 설치 및 운영 참고: 기계 건설 운동 TW에 설계도 대 한 보충 그림 1 을 참조 하십시오. 부품 재료의 테이블에에서 나열 됩니다. 어구 “TW”, “TreadWheel”, “운동 기계”, 및 “기계”는 프로토콜을 통해 같은 의미로 사용 됩니다. 보정 되도록 전체 회전 기간 15 전원 스위치를 사용 하 여 모터 s (4 rpm). 회전 팔에 연결 된 보안된 클램프로 플라이 튜브를 배치 하기 전에 기계 회전 속도 보정. 표준 초시계와 일시적으로 작은 페인트 브러시 회전 괄호 중 하나를 만지고 그냥 브러쉬 모터 커버 테이프 등 컴퓨터에 연결 된 부동 개체를 사용 하 여 속도 조정 합니다. 회전 수를 기준점으로 부동 개체를 사용 하 여 1 분에 시간과 15 s 회전 기간 (4 rpm)를 달성 하기 위해 속도 조정. 2. 비행 수집 및 유지 보수 참고: 모든 파리 50% 습도 및 아래에서 설명 하는 벤치탑 조작 사이 12 h 명암 주기 25 ° C 인큐베이터에 유지 됩니다. 파리는 다른 설명이 없는 한 표준 cornmeal 당 밀 랩 다이어트를 먹인 다. 애벌레로 부 화는 달걀을 수집을 애플 주스 한 접시, 접시, 당 효 모 반죽과 6 온스 플라스틱 병의 한 방울을 사용 하 여 관심사의 각 유전자 형에 대 한 누워 챔버를 준비 합니다. 준비 애플 주스 한 천 배지, 3% 천 35 m m x 10 m m 접시 ¾-전체 채우기가 사과 주스에 녹아. 사용까지 냉장고에 응고 접시를 저장. 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서가 활성 건조 효 모 누 룩의 각 그램에 물 2 mL의 비에 증류수 결합 되어 있습니다. 케 찹 유리 교 반 막대를 사용 하 여 일관성 붙여넣기를 만드는 물으로 혼합 효 모. 원하는 일관성을 달성 하기 위해 필요에 따라 누 룩과 물 비율을 조정 합니다. 사용 하는 사이 냉장고에서 효 모 반죽을 저장 합니다. 튜브 캡 드 가스 처리 있도록 느슨한 유지. 날카로운 바늘을 사용 하 여 또는 6 온스에 작은 구멍을 펀치 칼 누워 챔버에 대 한 환기 구멍으로 광장 아래쪽 병 (폴 리 프로필 렌). 각 애플 주스 한 천 격판덮개에 효 모 반죽 (직경에서 3 m m)의 작은 자리를 줘 봐. 6 온스 병 및 사과 주스 한 천 배지와 모자 병에 원하는 유전자 형의 성인 파리를 배치 합니다. 고무 밴드와 함께 병에 접시를 보호 합니다. 반전, 그리고 성인 계란을 낳을 수 있도록 인큐베이터에 배치. 애플 주스 한 천 배지는 누워 실에는 하루에 두 번 (아침과 저녁) 변경 합니다. 첫 번째 수 있도록 또 다른 12-24 h에 대 한 인큐베이터에서 두고 사용 접시 애벌레 부 화를 탈피 하 고 수집 처음에 얇은 붓 또는 컬렉션 선택 (유연한 얇은 바늘 핸들에 연결 된)를 사용 하 여 애벌레 탈피. 장소 50 처음 개발을 원하는 실험 음식 유형 및 완전 변성 동안 인큐베이터 (그림 2A)에 음식 유리병에 특정 유전자 형의 애벌레 탈피. 성인 운동 치료 (그림 2A)에 대 한 수집 합니다. Pupation에 작은, 젖은 붓으로 번데기를 수집 하 고 빈 튜브 일수로 성인 파리 애벌레 다이어트에 노출 되지 않도록 하려면 이전에. Eclose 그들은 표준 실험실 다이어트 음식 튜브를 성인 파리를 전송 합니다. 일수로, 후 1 ~ 5 일 파리 섹스에 따라 구분 합니다. 성인의 수집 된 각 실험에 지정 반 고 제어 그룹. 병 당 50 파리의 농도에서 표준 랩 다이어트의 튜브에 파리를 유지 합니다. 전송 성인 신선한 음식 튜브를 매 2 일 운동을 하는 동안 붙어 점점에서 그들을 방지 하기 위해. 파리를 도입 하기 전에 즉시 새로운 음식에 보충 라이브 누 룩의 몇 가지 곡물을 추가 합니다.참고: 그것은 살아있는 효 모 보충 없이 파리를 유지 수, 우리는 발견 성인 파리 최고의 보완 수행. 살아있는 효 모 보충 연구자의 실험 목표에 맞게 수정할 수 있는 변수 이다. 3. 운동 프로토콜 운동 (1 일)의 첫 날, 푸시 유리병 음식과 운동 튜브 (그림 1C)에 플러그 사이 공간 제어 튜브에 1 cm와 6 cm의 공간을 떠나 플러그.참고: 제어 튜브 운동 기계에 이동 하는 파리에 대 한 공간이 제한 됩니다 고 따라서 파리에 참여 합니다 많은 운동 튜브에 보다 덜 운동. 튜브 클램프, 놓고 그 후 파리에 게 10 분 (그림 1B) 기계에 적응.참고: 일반적으로 이동 하는 벤치탑에 하기 파리 6 cm 간격 (유리병) 운동 기계에 인접 한 유지 하는 대체 컨트롤이입니다. “TreadWheel에 1 cm” 및 “6 cm 벤치탑에” 컨트롤 운동의 비슷한 결과11을발견 되었습니다. 모두 제어 치료를 운동 회전 기계에 일정 한 실내 온도에서 회전 및 나머지 (그림 1D)의 복싱 교류 주당 5 일 연속에 대 한 있습니다.참고: 일정 한 온도 활동 수준에 온도의 혼란 효과 피하기 위해 필요 합니다. 온도 조작 연구, 운동 훈련 기간 동안 온도 처리를 수정 하는 인큐베이터 안에 TW를 놓습니다. 주 1 일 운동의 4 15 분 복싱에 대 한 컴퓨터를 실행 합니다. 이러한 관찰 5 분 휴식 기간으로 대체. 다음 일 기존 운동 복싱 중 운동 5 분을 추가 합니다. 예를 들어 하루 2, 첫 번째 운동 시 합 20 분 길이, 만들지만 긴 15 분 복싱의 나머지를 유지. 3 일에 첫 두 복싱 동안 및 15 분 20 분 파리 다음 두 복싱에 대 한 운동. 4 일에 15 분 긴 해야 최종 시 합을 제외 하 고 모든 20 분 운동 복싱을 사용 합니다. 5 일째에 모든 운동 복싱 20 분 오래 유지.참고: 나머지 기간 동안, 파리를 포함 하는 튜브 있어야는 TW에 안전 하 게 클램프 합니다. 이 기간 동안 튜브의 방향 모든 파리에 의해 경험 중력 같은 방향에서 올 것입니다 때문에 무관 하다. 특정된 날짜에 대 한 운동 치료를 완료 한 후 그들의 정상적인 위치로 식품 유리병 플러그를 반환 하 고 날까지 그들의 부 화기에 파리를 반환 합니다. 전체 운동 정권의 완료 anesthetize 후 파리 표준을 사용 하 여 CO2 마 취 방법을 비행. 다음 전송 새로운 음식 튜브 또는 microcentrifuge 튜브의 phenotypic 특성의 평가 대 한 이동합니다.참고: 예를 들어 고기 등반 능력 (식품 유리병), 트리 글리세라이드 스토리지 (microcentrifuge 튜브), 또는 유전자 발현 (microcentrifuge 튜브) 포함. 프로토콜 수행 평가 따라 적절 하 게 저장 하는 샘플 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 살아있는 파리를 포함 분석 phenotypic 분석 결과의 특정 목표에 따라 신속 하 게 실시 해야 합니다. 4. 등반 평가 나머지 운동 프로토콜의 완료 후의 어느 날, 후 빠른 반복 부정적인 geotaxis (반지)를 사용 하 여 성능을 등반 일반 비행 테스트-22시험의 부정적인 geotaxis 등반 처럼. 빈 유리병에 그룹 10 파리의 장소 CO2 마 취를 사용 하 여 (또는 경우 이미 정렬 음식 튜브에서 직접 도청) 파리 탈출 하지 못하도록 파라핀 필름으로 밀봉. 새로운 병에 적응 파리 적어도 10 분에 게. 이상의 팁을에서 병을 방지 하기 위해 추가 면적을 제공 하는 유리병의 바닥에 ~ 5 cm 직경 두꺼운 용지 원 테이프.참고: 병 마 개 사용할 수 없습니다 그들은 높이 결정 하는 데 사용 하는 유리병의 일부를 방해 하기 때문에 올랐다. 내장 타이머 (타이머 카메라 응용 프로그램 작동 잘와 스마트폰) 탑재, 고정 된 카메라의 전체 보기에 튜브 1 cm × 1 cm 그리드 앞 20cm를 배치 합니다. 유리병의 바닥 아래로 모든 파리를 노크 카운터 3 번에 부드럽게 튜브를 누릅니다. 3 시간 유리병, 도청 후 즉시 4 s 카메라 타이머 각 비행에 의해 상승 하는 높이 확인 하려면 이미지 캡처를 시작 합니다.참고: 도청 할 수 일관 된 강렬에 및 도청으로 인해 파리의 응답에 있는 변화를 최소화 하기 위해 각 운동 제어 반면에서 같은 연구원에 의해. 실험, 병 당 3 개의 시험의 총 생산 사이 적어도 1 분 나머지와 함께 두 번, 4.1.3 단계를 반복 합니다. 등산 분석 결과 완료 된 후에 즉시 다른 분석에 대 한 파리를 보존, 플래시 액체 질소에 침수에 의해 파리를 동결. 얕은, 오픈 topped dewar 플라스 크를 사용 하 여 액체 질소로 ~ 5 cm의 깊이에 가득합니다. 전송 파리 dewar 플라스 크의 CO2 마 취 그리고 장소 튜브를 사용 하 여 작은 microcentrifuge 관에 액체 질소로 가득 합니다. 또는, CO2의 제거를 요구 하는 미래 분석 스냅 동결 파리 그들의 등반 튜브에서 직접 하단 액체 질소에 빠져들은 다음에 냉동된 파리를 전송 하는 동안 그들의 유리병의 바닥에 파리를 부드럽게 눌러 microcentrifuge 튜브 집게를 사용 하 여입니다.참고: 액체 질소 저온 이며 적절 한 보호 장비 및 객실 환기만 사용 해야 합니다. ImageJ23 멀티 포인트 선택 도구를 사용 하 여 프로세스 이미지. ImageJ 내 처리에 대 한 이미지를 엽니다. 각 개별 비행에 의해 상승 하는 거리를 계산 하기 위해 배경 그리드 종이에 따라 1 cm 규모를 설정 합니다. “선 도구” 도구 모음에서 추적 1 cm2 광장의 한쪽에 배경 그리드 종이에서 사용 합니다. “분석” 탭에서 클릭 하 고 “비율 설정”을 선택 합니다. ‘1.00’ 및 “cm’,” 길이의 단위 “확인 되었는지”글로벌”,” 알려진 거리 “를 설정 하 고”확인 “을 클릭 합니다. 도구 모음에서 “멀티 포인트 선택” 아이콘을 선택 하 고 이미지에서 유리병의 하단에 확대. 유리병의 가장 낮은 부분에 클릭 하 여 유리병의 맨으로 첫 번째 점을 설정 합니다. 데이터 요소 표시를 유리병에 각 비행의 중앙에 클릭 하십시오. 유리병 11 포인트, 유리병의 바닥을 표시 한 고 각 비행에 대 한 하나는 기록해 둡니다. “분석” 탭에서 클릭 하 고 “측정” 측정 된 값의 테이블을 생성을 선택 합니다. Csv 파일에서 테이블을 저장 합니다. 스프레드시트 프로그램에서 csv 파일을 열고 측정된 값 테이블에서 포인트 1에서 2-11 점의 y 값을 빼서 각 비행에 의해 상승 하는 정확한 거리를 계산 합니다. 각 이미지에 대 한 4.3.1 4.3.6 통해 단계를 반복 합니다. 5. 트리 글리세라이드 스토리지 분석 결과 참고: 샘플, 표준, 글리세롤 표준 솔루션 및 triglycerol 작업 솔루션 분석 결과 전체 사용 프로토콜의 동안 얼음에 보관 해야 하 고 때 사용 중인 냉장고에 저장 한다. 글리세롤 표준 솔루션을 사용 하 여 표준 준비. B. 표시 된 microcentrifuge 튜브를 균질 버퍼의 1000 µ L을 추가 하 여 빈 (B) 만들기 글리세롤 표준 솔루션의 1000 µ L s 1 라는 microcentrifuge 튜브에 추가 하 여 표준 1 (S1), 잘, 당 2.5 mg/mL를 확인 합니다. 표준 2 (S2), 잘, 당 1.25 mg/mL 500 µ L 글리세롤 표준 솔루션의 diH2O s 2 라고 표시 된 microcentrifuge 관에서의 500 µ L을 추가 하 여 확인 합니다. 글리세롤 표준 솔루션의 250 µ L diH2O s 3 라는 microcentrifuge 튜브에 750 µ L을 추가 하 여 표준 3 (S3), 잘, 당 0.625 mg/mL를 확인 합니다. S4 표시 microcentrifuge 튜브에 diH20의 875 µ L을 125 µ L의 글리세롤 표준 솔루션을 추가 하 여 표준 4 (S4), 잘, 당 0.3125 mg/mL를 확인 합니다. 혈 청 트리 글리세라이드 결정 키트에서 triglycerol 작업 솔루션을 준비 합니다. 키트에서 무료 글 리세 린 시 약을 diH2O의 40 mL를 추가 하 고 병을 반전 하 여 혼합. 키트에서 트리 글리세라이드 솔루션 diH2O 10 mL을 추가 하 고 병을 반전 하 여 혼합. 글리세롤 시 약 및 트리 글리세라이드 솔루션을 결합 하 고 반전 triglycerol 작업 솔루션을 준비 하 여 혼합.참고: triglycerol 작업 솔루션 60 일 동안 좋은 이며 아래 프로토콜을 사용 하 여 키트 당 4 96 잘 접시 분석을 완료할 수 있습니다. 사용 된 볼륨 96 잘 접시 형식에 사용 하기 위해 공식 혈 청 트리 글리세라이드 결정 키트에서 비례 축소 됩니다. 신중 하 게 각 표준의 5 µ L 96 잘 평면 바닥, 3 중 (또는 quadruplicate는 빈에 대 한) 명확한 microplate에 pipetting으로 빈 및 표준 확인 합니다. 각 잘을 포함 하는 표준에 Triglycerol 작업 솔루션의 정확 하 게 125 µ L를 추가 합니다. 30 분 동안 반응 솔루션을 허용 합니다. 분 광 광도 계에 96 잘 접시를 놓고 540에서 흡 광도 읽고 nm. 흡 광도 측정을 사용 하 여 표준 곡선을 작성 하 고 R2 값을 계산 하 여 표준의 정확도 확인 합니다. 기준에 대 한 R2 를 사용 하 여 0.98 보다 작으면, 표준에 더 신중 하 게 준비 다시. 트리 글리세라이드 저장14 냉동 10를 포함 하는 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 분석 결과의 1 일 시작 각 난다.참고: 반복 또는 다중 채널 피 펫 해야 결코 사용이 단계에서 분석 결과에서 사용 하는 각 시 약의 양을 아주 정확 하 고 재현 가능한 결과 얻으려면 일관 해야 하기 때문에. 우리의 경험에서는, 반복 및 다중 채널 펫 필요가 없습니다이 정도의 정확성과 일관성. 단일 채널 피 펫에서 각 약 수를 시각적으로 품질 관리에 대 한 실험에 의해 확인 될 수 있다 하 고 어떤 단일 채널 피 펫 전용 편견 같은 정도로 모든 샘플에서 경험이 될 것입니다. KH2포40.272 g, 0.5 M EDTA의 400 µ L 199.6 mL diH2유리병에 O의 결합 하 여 균질 버퍼의 200 mL 재고를 준비 합니다. 10 성인 등산 분석 결과 후 동결을 포함 하는 40 microcentrifuge 튜브의 각 균질 버퍼의 정확히 100 µ L를 추가 합니다. 다음, 30에 대 한 샘플을 원심에서 18000 g s. 갈기 전동된 그 라인 더와 유 봉 (또는 다른 형태의 조직 균질) 밀키 솔루션 준비 하를 사용 하 여 이동 합니다. 각 샘플에 사용 되는 신선한 유 봉 다는 것을 확인 하십시오. 그런 다음, 원심 18000 g에서 2 분에 대 한 샘플. 새로운 microcentrifuge 튜브로만 각 관에서 표면에 뜨는 액체의 정상 75 µ L 플라스틱. 펠 릿에서 아무 비행 비트 이상의 전송 됩니다 확인 하십시오. 냉장고에 하룻밤 새 튜브를 배치 합니다. 냉장고에서 하루 1 샘플을 제거 하 여 트리 글리세라이드 프로토콜의 주 2를 시작 합니다.참고: 단계 5.5 5.4로 같은 날 수행 수 있습니다 하지만 우리는 냉장고에 하룻밤 후 더 강력한 수 트리 글리세라이드 농도 대 한 신호를 발견. 그러나, 단계 5.4와 5.5 사이 시간 36 h를 넘지 말아야 한다. (선택 사항) 10 s와 피 펫에 대 한 표면에 뜨는 액체와 함께 첫 번째 튜브 소용돌이 깨끗 한 microcentrifuge 관으로 5 µ L. 새로운 microcentrifuge 튜브에 0.15 M NaCl의 95 µ L를 추가 합니다. 원하는 경우 이러한 하위 단백질의 분석 결과 나중에-20 ° C 냉동 실에 저장 합니다.참고: 이러한 샘플 추가 NaCl 솔루션 상쾌한의 단백질 콘텐츠 연구원의 선호 분석 결과 사용 하 여 결정 하 사용할 수 있습니다. 우리24브래드 메서드 사용합니다. 단백질 콘텐츠 표준화 중성 지방 콘텐츠를 측정 하는 방법입니다 하지만 연구원 또한 운동 이후 이러한 비율을 해석에 신중 해야 한다 고 다이어트도 단백질 저장에 영향을 미칠 수 있습니다. 원래 표면에 뜨는 튜브에 대 한 소용돌이 10 s, 다음 피 펫 5 µ L 96 잘 microplate 기술 생산의 두 개의 별도 우물으로 표면에 뜨는 액체와 함께 첫 번째 튜브 복제 합니다. 웰 스는 각 샘플에 대 한 사용 됩니다 참고를 해야 합니다. 39 다른 튜브에 대 한이 단계를 반복 합니다. 미 판의 4 개의 우물에 빈의 정확히 5 µ L 플라스틱 그리고 나머지 우물 3 중에서 각 표준의 정확히 5 µ L 플라스틱. 각 음을 정확히 125 µ L triglycerol 작업 솔루션을 추가 하 고 30 분 동안 반응 솔루션을 허용. 분 광 광도 계에 96 잘 접시를 놓고 540에서 흡 광도 읽고 nm. 기준에서 계산 표준 곡선을 사용 하 여 농도 (mg/mL)으로 흡 광도 값을 변환 합니다.