Ici, nous présentons un protocole de détails les aspects techniques et des exigences essentielles pour assurer l’analyse de séquence génique IG robuste chez les patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC), basé sur l’expérience accumulée de l’initiative européenne de recherche sur CLL (ERIC).
Durant la maturation des lymphocytes B, le complex processus de recombinaison de V (D) J immunoglobuline (IG) gène couplé avec le hypermutation somatique (SHM) donne lieu à une séquence unique d’ADN dans chaque cellule individuelle de la B. Puisque B cellules malignes résultent de l’expansion clonale d’une seule cellule, les gènes IG représentent une signature moléculaire unique commune à toutes les cellules malignes dans un patient individuel ; ainsi, les réarrangements génétiques IG peuvent être utilisés comme marqueurs clonales. En plus d’être un important identificateur clonal, la séquence du gène IG peut agir comme un « scénario moléculaire » puisqu’elle est associée à des stades de développement spécifiques et donc reflète l’histoire de la cellule B impliquée dans la transformation néoplasique. En outre, pour certaines tumeurs malignes, en particulier leucémie lymphoïde chronique (LLC), la séquence du gène IG détient des capacités pronostiques et prédictifs potentiellement. Cela dit, en extrapolant à partir des conclusions significatives de l’analyse de séquences de gènes IG serait impossible si les outils et méthodes robustes n’étaient pas disponibles pour aider à leur analyse. Cet article, s’appuyant sur la vaste expérience de l’Initiative européenne de recherche sur les CLL (ERIC), les détails les aspects techniques et les exigences essentielles nécessaires pour fiable et reproductible IG gène le séquençage en CLL, un test qui est maintenant recommandé pour tous les patients atteints de LLC avant le traitement. Plus précisément, les différentes étapes d’analyses sont décrites allant de l’identification du réarrangement génique clonotypiques IG et la détermination de la séquence nucléotidique de l’interprétation clinique précise les données de séquence de gène IG.
Leucémie lymphoïde chronique (LLC), la forme la plus courante de la leucémie chez l’adulte dans les pays occidentaux, se caractérise par l’expansion clonale de cellules de B néoplasiques mature1. D’un point de vue clinique, l’évolution de la maladie est extrêmement variable avec certains patients touchés par une maladie agressive, nécessitant un traitement très tôt après le diagnostic et souvent récurrente ou d’être réfractaire au traitement. Ceci est en contraste frappant avec une proportion importante de patients (environ 30 %) qui présentent une maladie indolente, jamais nécessitent un traitement et ont une espérance de vie similaire aux individus de même âge en bonne santé2. Cette hétérogénéité clinique se reflète dans la diversité des anomalies moléculaires dans les patients atteints de LLC qui conduisent au bout du compte la pathogenèse et l’évolution de cette maladie3.
Établir qu’un diagnostic précis de la CLL est généralement simple, cependant, l’hétérogénéité clinique susmentionnée peut entraver la gestion efficace des patients atteints de LLC et souligne la nécessité pour les marqueurs pronostiques et prédictifs pouvant aider à traitement décisionnel2. De nombreuses études ont tenté d’affiner le pronostic de la LLC, qui a abouti à une abondance de nouveaux marqueurs cliniques et biologiques étant proposé4. Le statut mutationnel du gène clonotypiques immunoglobuline lourd variable (IGHV) est l’un des marqueurs pronostiques plus robustes en CLL, largement dû au fait que (i) elle reste stable dans le temps et que la maladie progresse, et (ii) il est indépendant des autres 5de paramètres cliniques et biologiques. Que malgré tout, des marqueurs très peu, voire aucune, y compris le statut mutationnel IGHV, sont actuellement appliquées en routine clinique au moment du diagnostic.
Des rapports initiaux sur l’utilité clinique du séquençage des gènes IG dans datent CLL dès 1999, lorsque 2 études indépendantes ont indiqué que les patients avec no ou une charge minimale hypermutation somatique (SHM) (CLL unmutated, LLC-U) ont un pronostic plus mauvais que les patients portant un charge supérieure de SHM (muté CLL, LLC-M)6,7. Plus précisément, le groupe de U-CLL comprenait des cas contenant les gènes IGHV clonotypiques avec peu ou pas de SHM et donc une forte identité pourcentage au gène IGHV de la lignée germinale plus proche (≥ 98 %), tandis que M-CLL se composait des cas avec une charge plus élevée de mutational (pourcentage identité à la gène IGHV plus proche germline < 98 %). Depuis ces premières études, on a sans cesse démontré que des cas de U-CLL affichent un court temps-à-premier traitement (TTFT) et la survie globale (OS) par rapport à M-CLL.
Avec le recul, ces études séminales a mis en évidence le rôle essentiel du récepteur des cellules B (BcR) IG en biopathologie CLL, ouvrant ainsi la voie pour des recherches approfondies sur les relations CLL-micro-environnementales qui, à son tour, conduit à une compréhension plus approfondie des l’hétérogénéité biologique de cette maladie8,9. Des études plus récentes ont fourni un appui supplémentaire de l’importance des analyses immunogénétiques en CLL en révélant que des cas individuels peuvent regrouper en sous-ensembles en raison de partage (Quasis) séquences identiques du gène BcR IG, un phénomène appelé stéréotypie BcR IG10 ,11,12,13. Accumulant la preuve appuie l’idée que les patients assignés aux même sous-ensemble stéréotypés harbor clinicobiologique des propriétés semblables qui les séparent clairement d’autres patients atteints de LLC au sein de la même catégorie SHM mais avec différentes séquences de gènes IG ; Il a en effet été signalé que la catégorisation des patients atteints de LLC basée sur la stéréotypie BcR IG plus raffine la ségrégation en vrac des patients atteints de LLC en U-CLL ou M-CLL groupes14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
D’un point de vue clinique, il convient de noter que le statut SHM du gène IGHV clonotypiques semble corréler avec une réponse spécifique à la chimio. Chez M-CLL particulier, traités avec une combinaison de fludarabine/cyclophosphamide/rituximab (FCR), le traitement de l’étalon-or pour les patients atteints de LLC médicalement apte, dépourvu de défauts de gène TP53 , exposées sans progression significativement plus survie (PFS) et OS que U-CLL chez les patients qui ont reçu le même traitement21,22,23. Par conséquent, identification de l’État SHM est devenu importante en particulier pour aider à la prise en charge thérapeutique du CLL patients c’est-à-dire un marqueur prédictif, plutôt que pour l’évaluation de l’évolution clinique de la maladie c’est-à-dire, une marqueur pronostique. En effet, selon la récente mise à jour des directives de l’International Workshop on CLL parrainé par le NCI, le statut SHM des gènes réarrangés IGHV devrait être déterminé dans tous les cas CLL avant le début du traitement dans les deux omnipraticiens et clinique essais24. En outre, en raison de la récente approbation d’agents de traitement novateur et le nombre croissant de médicaments dans les essais, le statut SHM de la molécule d’IG peut jouer un rôle encore plus dans la prise en charge thérapeutique des patients atteints de LLC dans le futur proche5.
Ce rapport détaille tous les aspects de l’analyse de séquence du gène IG, commençant par le choix du matériau approprié et culminant avec l’interprétation clinique, les résultats de séquençage. Une évaluation approfondie de ces étapes est importante dans le diagnostic de routine pour la production de résultats fiables tout en assurant précise stratification patiente dans les essais cliniques. Protocoles sont présentés afin d’aider à l’harmonisation de l’analyse de séquence du gène IG, assurant ainsi que les résultats soient comparables entre les différents laboratoires.
L’étude des gènes des IG en CLL a été vital non seulement pour fournir une meilleure compréhension dans la pathologie de la maladie, mais aussi pour améliorer la stratification du risque patient. Il est donc primordial que la procédure en plusieurs étape de l’analyse de séquence de gène IG et interprétation ultérieure des séquences s’effectués de manière standardisée. La disponibilité du matériel patient approprié et suffisant et le calendrier d’échantillonnage ne devraient pas influer sur la capacité d’effectuer l’analyse mutationnelle gène IG étant donné que le test peut être effectué sur le PB et sur n’importe quel échantillon avec un nombre de cellules de tumeur CLL élevé. La séparation des cellules mononucléaires du sang à l’aide de méthodes de séparation dégradé est assurée dans les laboratoires de diagnostic, et comme toujours, il faut veiller lors de l’ajout de la solution de sang/RPMI dans le tube contenant le gradient ; cette tâche doit être effectuée d’une manière lente et douce pour ne pas perturber le gradient et prévenir la perte de cellules.
Suite à la séparation des cellules, les acides nucléiques sont extraits. Les deux ADNg et ARNC conviennent à l’analyse de la transposition de l’ISFH clonotypiques SHM, cependant, il y a des avantages et des inconvénients de l’utilisation d’un matériau. Le flux de travail de laboratoire produit plus rapidement lorsque vous utilisez ADNg puisque aucune transcription inverse ne doit être effectué avant l’amplification par PCR. Cela dit, à l’aide de gDNA comme substrat pour la PCR peut entraîner l’amplification des réarrangements productives et non productives qui, à son tour, peut conduire à des travaux de laboratoire pratique supplémentaire, c’est-à-dire, de purification ou l’excision gel de multiples produits PCR et le séquençage individuel de tous les réarrangements. Si l’on compare les approches génomique et de la cDNA, pour ce dernier une étape de transcription inverse doit être effectuée avant de procéder à l’amplification par PCR. Toutefois, en l’occurrence, pour la plupart des cas, seulement les réarrangements IG productives seront amplifiés et séquencés par la suite. Ainsi, seulement un seul produit PCR sera purifié et séquencé, tandis que l’interprétation des résultats est plus simple.
L’efficacité de l’amplification dépend largement de la qualité de l’ADNg/ADNc, qui devraient être évalué à l’aide d’une méthode de quantification sensible et les amorces utilisées. Les amorces utilisées sont essentiels à l’ensemble de la procédure analytique, parce que la détermination précise du niveau SHM n’est possible que par amplifier la séquence complète du gène réarrangé IGHV. Un réarrangement pleine longueur ne peut être apprécié que si 5′ IGHV chef amorces sont utilisées, ce qui justifie les recommandations récentes par ERIC pour l’utilisation du chef amorces27. L’utilisation d’autres amorces, conduisant à l’amplification des réarrangements de gènes IGHV-IGHD-IGHJ incomplets, n’est pas appropriée pour l’analyse mutationnelle du gène IGHV et donc fortement déconseillé. La seule exception concerne les cas qui à plusieurs reprises donnent des résultats négatifs lorsqu’on utilise des amorces de chef de file IGHV et analyse d’un nouveau patient est soit pas possible ou également ne pas donner des résultats. Si utilisation d’un échantillon de patients différent et/ou matériel (ADNg/cDNA) et diverses amorces définit encore ne parviennent pas à produire un produit PCR, raisons possibles pourraient être que le fardeau de la cellule tumorale est trop faible ou cette lymphocytose n’est pas due à un clone CLL (auquel cas la IMMUNOPHENOTYPE doit être réévalué). Les amorces utilisées pour l’analyse doivent toujours être indiqués dans le rapport clinique.
Comme le CLL résulte de l’accumulation de cellules de B monoclonales portant le même réarrangement génique de IGHV-IGHD-IGHJ, pour la grande majorité de clonalité cas évaluation révélera un pic monoclonal unique, c’est-à-dire un seul clone. En de rares occasions, double réarrangements ou même oligoclonales patrons peuvent être observées35. Dans ce cas, électrophorèse de gel n’est pas la technique de choix pour l’évaluation de la clonalité et appliquer des méthodes plus sensibles telles que l’analyse de fragment. Une fois la clonalité a été confirmée, la dernière étape avant le séquençage se rapporte à la purification du produit PCR pour s’assurer que les séquences de haute qualité sont obtenues. Enfin, l’outil IMGT/V-QUEST est la ressource recommandée pour l’analyse de la séquence IG par ERIC. Comme les bases de données IMGT sont constamment mis à jour et de faire rapport des résultats bien annotée de façon cohérente et, cet outil assure analyse standardisée et facilite l’analyse comparative entre les différentes installations cliniques ou académiques.
Comme immunogénétiques analyse en CLL a pronostic et, en particulier, incidences prédictives, analyse robuste du réarrangement génique IGHV-IGHD-IGHJ y compris l’attribution de grands sous-ensembles CLL stéréotypé, n’est plus seulement souhaitable, mais d’une importance capitale. Cela est particulièrement évident dans cette ère de nouvelles thérapeutiques et le potentiel que l’analyse du gène IG a pour guider le traitement décisions5,21,22,23,36,37 ,38, officiellement indiqué par la récente mise à jour des directives de l’International Workshop on CLL24parrainé par le NCI. Que lesdites normes rigoureux sont garantis, autant de détermination du statut de la clonotypiques SHM réarrangées de gène IGHV chez les patients atteints de LLC ne sont pas une mince affaire et implique un processus en plusieurs étapes. Surtout, certaines étapes expérimentales, sont respectées, notamment le choix des amorces, des résultats supérieurs de rendement quand spécifique des options ou approches, autres aspects techniques sont prêtent à un certain degré de flexibilité, comme le choix des matériaux ou la méthode d’évaluation de clonalité, dû au fait qu’elles conduisent à des différences subtiles, le cas échéant, en ce qui concerne les résultats définitifs.
Durant la dernière décennie, ERIC s’efforce de promouvoir la normalisation et l’harmonisation des différentes méthodes pertinentes à CLL diagnostic et de pronostic. Cela se reflète dans les recommandations publiées et les lignes directrices pour l’analyse immunogénétiques27,34, nombreux ateliers pédagogiques organisés et événements, la mise en place d’un réseau de IG, ainsi qu’un forum en ligne d’experts à discuter et donner des indications sur les IG gène séquence interprétation au CLL. L’objectif global d’ERIC grâce à ces mesures est de promouvoir la prise en charge clinique optimale et des soins aux patients. Malgré des efforts intenses, cette tâche est loin d’être terminée et en fait est devenue plus complexe en raison de l’élaboration du nouveau séquençage haut débit visant à présenter le profil immunitaire. Néanmoins, même si les difficultés persistent, les efforts intensifs de la normalisation robuste d’analyse génique IG dans le CLL continuent et sont actuellement au centre des activités en cours au sein de ERIC.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les membres présents et passés de nos groupes de recherche, le groupe IgCLL et ERIC, pour leur engagement et leur enthousiasme dans l’étude immunogénétique de CLL. Nous tenons également à souligner la collaboration confiante de tous les membres de l’initiative IMGT/CLL-DB et, en particulier, professeur Marie-Paule Lefranc et Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d’Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite Montpellier II, Montpellier, France, IMGT, le système d’information international immunogénétique pour leur énorme appui et aide à l’analyse de séquences de gènes IG. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de TRANSCAN-179 roman JTC 2016 ; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 et spécial programme moléculaire clinique oncologie à 5 pour mille #9965), Milano (Italie) ; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rome, Italie ; La société du Cancer suédois, le Conseil de recherche suédois, Knut et Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Université d’Uppsala, Uppsala University Hospital et Cancer Research Foundation du Lion, Uppsala. Programme ODYSSEUS, relevant le « Action pour le développement sur the recherche et technologique secteur stratégique », financé par le Programme opérationnel « Compétitivité, entrepreneuriat et Innovation » (CRSN 2014-2020) et cofinancé par la Grèce et l’Union européenne (Fonds européen de développement régional).
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube – Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
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Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
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