Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme
Summary
Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için yöntemi açıklanmaktadır. Gen ekspresyonu doku bölümlerine de uygulanabilir geliştirme sırasında izlemek için kolay ve hızlı bir prosedür bu organ veya kültürlü hücreleri.
Abstract
Escherichia coli LacZ gene, β-galaktozidaz, kodlama büyük ölçüde gen ekspresyonu için muhabirlik ve hücre lineage çalışmalarda bir izleyici olarak kullanılır. Klasik histochemical reaksiyon görselleştirmek kolay bir çözünmez mavi çökelti üreten demir ve demir iyonları, birlikte substrat X-gal hidroliz temel alır. Bu nedenle, geliştirme ilerledikçe β-galaktozidaz etkinliği ilgi gen ifade desenini avans olarak hizmet vermektedir. Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için sonraki yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, tüm embriyoların açıkladığınız için bir yordam X-gal embriyo, daha derin bölgelerinde boyama daha iyi görmek için sağlanmıştır. Reaksiyon koşulları duruma getirilmesi arka plan etkinliği en aza indirmek için gerekli, ancak tutarlı sonuçlar bu yordamı uygulanarak elde edilir. Tahlil sınırlamalar da, özellikle bütün Dağı boyama içinde embriyo boyutu ile ilgili olarak düşünülmelidir. Bizim iletişim kuralı bir duyarlı ve daha fazla cryostat bölümler hem de bütün organları uygulanabilir fare geliştirme sırasında β-galaktozidaz algılama için güvenilir bir yöntem sağlar. Böylece, dinamik gen ifade desen geliştirme boyunca tüm embriyoların bu protokolü kullanarak kolayca çözümlenebilir, ama Ayrıca hücresel düzeyde ayrıntılı ifade parafin kesit sonra tespit edilebilir.
Introduction
Belirli bir gen ifade desenlerini tanımlamak için muhabir gen işaretleyici olarak kullanımı memeliler Drosophila en önemli olmuştur. Transgenik ve nakavt hayvanların deneylerde, Escherichia coli (e.coli) bakteriyel β-galaktozidaz gen (LacZ) en çok kullanılan1,2,3, biridir 4. β-galaktozidaz (β-gal) tromboksan β-galactosides (laktoz gibi) hidroliz onun bol (glikoz ve galaktoz)5. En sık kullanılan, substrat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galaktozidaz veren yükselmeye 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole ve galaktoz tarafından hidrolize bir parçalanma olduğunu. İlk bir dimer okside, kullanıldığında potasyum ferri ile kombine- ve ferro-siyanür, karakteristik çözünmez üretir, mavi renk çökelti (Şekil 1)6.
Otuz yıl önce bir muhabir gen kullanılacak LacZ gene başladı7,8. Genellikle, LacZ eklenen aşağı endojen bir organizatörü açık okuma çerçevesi yerine belirli bir INSERT içeren hücreler görselleştirmek için bakteri ve hücre kültür yanı sıra transjenik hayvanlar, endojen bir izleyici kullanılabilmesi için bu yüzden gen ifade desen geliştirme9sırasında. Bu bağlamda, β-galaktozidaz etkinliği görselleştirme kapsamlı Drosophila içinde tek hücrelerden gelişimsel ve hücresel süreçler tüm dokulara anlamak için kullanılmıştır. Drosophila genetik kararlı hatları içinde LacZ değil muhabiri gen içeren değiştirilmiş bir P-öğe yapısı eklenen rasgele genom yerlerde nesil lehine. Böylece, artırıcı unsurların etkisi altında yerleştirildiğinde bu ifadesini birçok genlerin ifade kalıplarının sistematik analizi sırasında son yirmi yılda10izin verdi bir doku belirli şekilde sürücü. Buna ek olarak, LacZ gen ekspresyonu izlemek için transgenik fareler de gen rekombinasyon olaylar Cre-loxP tarafından algılanmasını rekombinasyon ve yerelleştirme chimeric analizlerde mutasyona uğramış embriyonik kök hücre türevleri aracılı kullanılmasına 11, hangi geçici olarak de LacZ ifade belirli dokularda kontrolünü kolaylaştırır. Ayrıca, tüm embriyoların, algılama β-galaktozidaz faaliyetinin uygun gen ekspresyonu zamansal değişiklikleri analiz etmek için farklı gelişim dönemleri arasında gözlenen farklı yoğunluklarda, farklı boyama desenleri neden olabilir 8,12.
Bu makalede, biz bütün Dağı dokusunda fare embriyo erken gelişim aşamalarında boyama gen ekspresyonu ile X-gal görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz histochemical bu yöntem doku veya embriyo parafin gömülü sonra bütün Dağı örnekler veya hücresel düzeyde etiketli hücrelerinin doğru algılama iyilik bir son derece hassas ve ucuz teknik mevcut. Yöntemi diğer yöntemleri13ile karşılaştırıldığında en az arka plan ile fare dokusunda boyama doğrudan görüntüleme için sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
E. coli LacZ gene yaygın gen ifade kalıplarının çalışmalarda bir muhabir olarak kendi yüksek hassasiyet ve algılama kolaylığı nedeniyle kullanılmıştır. Mevcut Protokolü β-gal ifade yanı sıra ucuz gerçekleştirmek hızlı ve kolay bir enzimatik reaksiyon dayalı tespit için klasik bir yöntem açıklanır. Bu yöntem bütün Dağı embriyolar, sağlam organları, cryostat doku bölümleri veya kültürlü hücreler büyük değişiklik yapmadan da uygulanabilir.
B…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) histopatolojik hizmet onların teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Biz de Dr. Motoharu SEIKI nazikçe sağlayan Mt4 mmpLacZ fareler için ve Dr. Alicia G. Arroyo projemize destek için ve el yazması onun eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Peter Bonney Bu makale redaksiyon için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Universidad Europea de Madrid tarafından C.S.C. için layık bir hibe (# 2017UEM01) aracılığıyla destek verdi
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
Referências
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
