Rastreamento de expressão gênica, através da detecção de atividade de β-galactosidase em embriões de rato inteiro
Summary
Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método de parafina seccionamento e counterstaining. Este é um procedimento fácil e rápido para monitorar a expressão gênica durante o desenvolvimento, o que também pode ser aplicado às secções de tecidos, órgãos ou células cultivadas.
Abstract
O gene de Escherichia coli LacZ , codifica a β-galactosidase, é largamente utilizado como um repórter para a expressão de gene e como um tracer em estudos de linhagem celular. A clássica reação histochemical baseia-se a hidrólise do substrato X-gal em combinação com íons férricos e ferrosos, que produz um precipitado azul insolúvel que é fácil de Visualizar. Portanto, atividade de β-galactosidase serve como um marcador para o padrão de expressão do gene de interesse como o desenvolvimento prossegue. Aqui descrevemos o protocolo padrão para a detecção de atividade de β-galactosidase em embriões adiantados do rato inteiro e o método subsequente para parafina de seccionamento e counterstaining. Além disso, está previsto um procedimento para clarificar todo embriões para visualizar melhor o X-gal em regiões mais profundas do embrião. Resultados consistentes são obtidos por meio deste procedimento, apesar de otimização das condições de reação é necessária para minimizar as atividades do fundo. Limitações no ensaio devem ser também consideradas, particularmente sobre o tamanho do embrião no monte de toda mancha. Nosso protocolo fornece um sensível e um método confiável para detecção de β-galactosidase durante o desenvolvimento do mouse que pode ser mais aplicado para as seções do criostato, bem como os órgãos inteiros. Assim, os padrões de expressão de gene dinâmico durante todo o desenvolvimento podem ser facilmente analisados usando este protocolo em embriões de todo, mas também detalhada expressão a nível celular pode ser avaliada após corte de parafina.
Introduction
A fim de descrever os padrões de expressão de genes específicos, o uso de genes repórter como marcadores tem sido fundamental da drosófila para mamíferos. Em experimentos envolvendo animais transgénicos e nocaute, o gene bacteriano β-galactosidase (LacZ) de Escherichia coli (e. coli) é um dos mais amplamente utilizado1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalisa a hidrólise da β-galactosidioss (por exemplo, lactose) em seus monossacarídeos (glicose e galactose)5. Seu substrato mais comumente usado é o X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), um glucosídeo que é hidrolisado por β-galactosidase fundadas 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole e galactose. O primeiro é oxidado em um dímero que, quando usados combinados com potássio ferri- e ferro-cianeto, produz uma característica insolúvel, o precipitado de cor azul (Figura 1)6.
O gene LacZ começou a ser usado como um gene repórter, há mais de trinta anos de7,8. Geralmente, LacZ é inserida a jusante de um promotor endógeno no lugar do frame de leitura aberto, então ele pode ser usado na cultura bacteriana e célula para visualizar células contendo um encarte especial, bem como em animais transgénicos como um traçador de endógena padrões de expressão de genes durante o desenvolvimento,9. A este respeito, a visualização da atividade de β-galactosidase tem sido usada extensivamente em Drosophila para compreender os processos de desenvolvimento e celulares de células únicas para tecidos. Genética da Drosophila favorece a geração de linhas estáveis em que uma construção P-elemento modificada, contendo o gene repórter que lacZ é inserido aleatoriamente posições no genoma. Assim, quando colocado sob a influência de elementos potenciador pode dirigir sua expressão de maneira específica de tecido, que permitiu a análise sistemática dos padrões de expressão de diversos genes durante as duas décadas passadas10. Além disso, o uso de ratos transgênicos para monitorar a expressão do gene LacZ também permite a detecção de eventos de recombinação genética por Cre-loxP mediada por recombinação e localização dos derivados de células-tronco embrionárias mutante em análises quiméricoes 11, que facilita o controle da expressão de LacZ em tecidos específicos, bem como temporalmente. Além disso, em todo embriões, deteção da atividade β-galactosidase pode produzir padrões de coloração diferenciais em intensidades diferentes que podem ser convenientemente observados em diferentes estádios de desenvolvimento para analisar mudanças temporais na expressão do gene 8,12.
Neste artigo, apresentamos um protocolo para visualizar a expressão do gene através do X-gal mancha no tecido toda montagem em estágios iniciais de desenvolvimento de embriões do rato. Apresentamos este método histoquímico como uma técnica altamente sensível e de baixo custo que favorece a detecção precisa das pilhas etiquetadas em espécimes de montagem inteira ou a nível celular, depois incorporado de parafina tecidos ou embriões. O método permite a visualização directa da mancha no tecido do mouse com o plano de fundo mínimo quando comparado com outros métodos de13.
Protocol
Representative Results
Discussion
O gene LacZ Escherichia coli tem sido amplamente utilizado como um repórter em estudos de padrões de expressão de gene, devido à sua alta sensibilidade e facilidade de deteção. O presente protocolo descreve um método clássico para detectar a expressão de β-gal, baseado em uma reação enzimática que é fácil e rápido para executar, bem como o baixo custo. Esse método pode ser aplicado também sem grandes modificações em embriões de toda montagem, órgãos intactos, seções do criostato do tecid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o serviço histopatológico para sua assistência técnica com o Centro Nacional de investigações Cardiovasculares (CNIC). Também agradecemos a Dr. Motoharu Seiki para fornecer gentilmente Mt4-mmpLacZ ratos e Dr. Alicia G. Arroyo para apoiar nosso projeto e para a leitura crítica do manuscrito. Gostaríamos de agradecer Peter Bonney para revisão deste artigo. Este trabalho foi apoiado pela Universidad Europea de Madrid por meio de uma subvenção (# 2017UEM01) atribuída a C.S.C
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
Referências
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