Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen
Summary
Hier beschreiben wir das Standardprotokoll für die Erkennung von β-Galaktosidase Aktivität in frühen ganze Maus-Embryonen und die Methode für die Paraffin-Schnitt und gegenfärbung. Dies ist ein einfaches und schnelles Verfahren, Genexpression während der Entwicklung zu überwachen, auch die Gewebeschnitte, angewendet werden können, Organe oder kultivierten Zellen.
Abstract
Die Escherichia coli LacZ gen, β-Galaktosidase wird weitgehend als Reporter für die Genexpression und als Tracer in Zell-Linie Studien verwendet. Die klassische histochemische Reaktion basiert auf der Hydrolyse des Substrats X-gal in Kombination mit Eisen und Eisen-Ionen, die einen unlöslichen blauen Niederschlag, das einfach produziert zu visualisieren. Daher dient β-Galaktosidase Aktivität als Marker für das Muster des Ausdrucks des Gens von Interesse, wie die Entwicklung verläuft. Hier beschreiben wir das Standardprotokoll für die Erkennung von β-Galaktosidase Aktivität in frühen ganze Maus-Embryonen und die nachfolgende Methode für Paraffin-Schnitt und gegenfärbung. Darüber hinaus ist ein Verfahren zur Klärung der ganzer Embryos zur Verfügung gestellt, um X-gal-Färbung in tiefere Regionen des Embryos besser zu visualisieren. Konsistente Ergebnisse erhält man durch die Durchführung dieses Verfahrens, obwohl Optimierung der Reaktionsbedingungen benötigt wird, um die Hintergrundaktivitäten zu minimieren. Einschränkungen in der Probe sollte betrachtet werden, insbesondere im Hinblick auf die Größe des Embryos in der ganze Berg Färbung. Unser Protokoll bietet eine sensible und eine zuverlässige Methode für β-Galaktosidase-Erkennung bei der Maus-Entwicklung, die den Kryostaten Abschnitte sowie ganze Organe weiter angewendet werden kann. So, die dynamische gen Expressionsmuster während der gesamten Entwicklung mithilfe dieses Protokolls in ganzen Embryonen leicht analysiert werden können, sondern auch detaillierte Ausdruck auf zellulärer Ebene nach Paraffin-Schnitt beurteilt werden kann.
Introduction
Um spezifische gen Expressionsmuster zu beschreiben, ist die Verwendung von Reporter-Gene als Marker von Drosophila , Säugetiere von größter Bedeutung gewesen. In Experimenten mit transgenen und Knockout Tieren ist das bakterielle β-galaktosidase-Gen (LacZ) von Escherichia coli (E. Coli) eines der am weitesten verbreitete1,2,3, 4. β-Galaktosidase (β-gal) katalysiert die Hydrolyse von β-galactosiden (z. B. Laktose) in seine Monosaccharide (Glukose und Galaktose)5. Die am häufigsten verwendeten Substrat wird X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), ein Glykosid, das durch β-Galaktosidase geben Anlass zu 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole und Galactose hydrolysiert wird. Die erste ist in ein Dimer oxidiert, bei Verwendung in Kombination mit Kalium Ferri- und Ferro-Cyanid, produziert eine charakteristische unlöslich, blauer Farbe Niederschlag (Abbildung 1)6.
Das LacZ gen begonnen, als ein Reportergen vor über dreißig Jahren verwendet werden7,8. In der Regel LacZ eingefügt nachgeschaltet eine endogene Veranstalter an die Stelle der offenen Leserahmen, sodass es in Zelle und bakterielle Kultur, Zellen mit einem bestimmten Einsatz zu visualisieren sowie bei transgenen Tieren als Tracer von endogenen verwendet werden kann gen Expressionsmuster während Entwicklung9. In diesem Zusammenhang ist die Visualisierung der β-Galaktosidase Aktivität beträchtlich in Drosophila benutzt worden, um zu verstehen, die Entwicklungs- und zelluläre Prozesse aus einzelnen Zellen ganze Gewebe. Drosophila Genetik zugunsten die Generation stabile Linien, in denen eine modifizierte P-Element Konstrukt, enthält das Reportergen LacZ ist nach dem Zufallsprinzip Standorte im Genom eingefügt. So kann wenn unter dem Einfluss von Enhancer-Elemente platziert es seinen Ausdruck Gewebe gezielt, fahren, die die systematische Analyse der Expressionsmuster vieler Gene während den vergangenen zwei Jahrzehnten10erlaubt hat. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von transgenen Mäusen LacZ -gen-Expression zu überwachen auch Erkennung von Gen rekombinationsereignisse von Cre-LoxP vermittelte Rekombination und Lokalisierung der mutierten embryonalen Stammzellen Derivate in Chimären Analysen 11, erleichtert die Kontrolle des LacZ Ausdruck in bestimmten Geweben sowie wie zeitlich. Auch kann im ganzen Embryonen, Erkennung der β-Galaktosidase Aktivität differentielle Färbung Muster bei verschiedenen Intensitäten produzieren, die bequem in verschiedenen Entwicklungsstadien zu zeitliche Veränderungen in der Genexpression analysieren beobachtet werden können 8,12.
In diesem Artikel präsentieren wir ein Protokoll zur Genexpression durch X-gal visualisieren im ganzen Berg Gewebe in frühen Entwicklungsstadien von mäuseembryonen Färbung. Wir präsentieren diese histochemische Methode als eine hochempfindliche und kostengünstige Technik, die präzise Erkennung der markierten Zellen im ganzen Mount Proben oder auf zellulärer Ebene begünstigt, nachdem Paraffin Gewebe oder Embryonen eingebetteten. Die Methode ermöglicht die direkte Visualisierung der Färbung im Maus-Gewebe mit dem minimalen Hintergrund im Vergleich zu anderen Methoden13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das E. Coli LacZ gen hat als Reporter im Studium der Gen-Expression-Muster aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit und einfache Erkennung verbreitet. Dieses Protokoll beschreibt eine klassische Methode zur Erkennung von β-gal Ausdruck basiert auf einer enzymatischen Reaktion, das einfach und schnell sowie kostengünstig durchführen. Diese Methode kann auch ohne große Änderungen im ganzen Berg Embryonen, intakt Organe, Kryostat Gewebeschnitte oder kultivierten Zellen angewendet werden.
<p class="jove_conten…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die histopathologische Service für ihre technische Unterstützung an das Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) bedanken. Wir danken auch Dr. Motoharu Seiki freundlicherweise die Mt4-MmpLacZ -Mäuse und Dr. Alicia G. Arroyo für unser Projekt zu unterstützen und ihre kritische Lektüre des Manuskripts. Wir wünschen Peter Bonney für Korrekturlesen dieses Artikels danken. Diese Arbeit wurde von Universidad Europea de Madrid durch ein Stipendium (# 2017UEM01), C.S.C unterstützt.
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
Referências
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
