تتبع التعبير الجيني من خلال الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة كله الماوس
Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول قياسي للكشف عن النشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة الماوس كله في وقت مبكر وأسلوب البارافين تمزيقها وكونتيرستينينج. هذا هو إجراء سهل وسريع لرصد الجينات أثناء التطوير التي يمكن أن تطبق أيضا على أقسام الأنسجة، الأجهزة أو الخلايا المستزرعة.
Abstract
ويستخدم الجين الإشريكيّة القولونية لاكز ، ترميز β-جالاكتوسيداسي، إلى حد كبير كمراسل للتعبير الجيني وتتبع في الخلية النسب الدراسات. رد فعل histochemical الكلاسيكي يرتكز على التحلل المائي للركيزة X-غال في تركيبة مع أيونات الحديديك والحديدية، التي تنتج ترسبات زرقاء غير قابلة للذوبان من السهل تصور. ولذلك، β-جالاكتوسيداسي النشاط بمثابة كعلامة لنمط التعبير للجينات لمصلحة التنمية العائدات. هنا يصف لنا بروتوكول قياسي للكشف عن النشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة الماوس كله في وقت مبكر وأسلوب البارافين تمزيقها وكونتيرستينينج لاحقاً. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفيرها من إجراء لتوضيح الأجنة كله تصور أفضل X-غال تلطيخ في مناطق أكثر عمقاً للجنين. يتم الحصول على نتائج متسقة قبل تنفيذ هذا الإجراء، رغم الحاجة إلى تحسين ظروف رد فعل لتقليل النشاط الخلفية. ينبغي أيضا النظر قصور التحليل، لا سيما فيما يتعلق بحجم الجنين في جبل كله تلطيخ. وينص البروتوكول لدينا حساسة وطريقة موثوقة لكشف β-جالاكتوسيداسي أثناء وضع الماوس التي يمكن تطبيقها كذلك على أبواب كريوستات، فضلا عن أجهزة كاملة. وهكذا، يمكن تحليل أنماط تعبير الجينات الحيوية في جميع أنحاء التنمية بسهولة باستخدام هذا البروتوكول في الأجنة كلها، ولكن كما يمكن تقييم التعبير مفصلة على المستوى الخلوي بعد تقطيع البارافين.
Introduction
من أجل وصف أنماط التعبير الجيني محددة، تم استخدام الجينات مراسل كعلامات قصوى من المورفولوجية للثدييات. في التجارب التي تنطوي على الحيوانات المحورة وراثيا والضربة القاضية، الجين البكتيري β-جالاكتوسيداسي (لاكز) من الإشريكيّة القولونية (كولاي) واحدة من الأكثر استخداماً1،2،3، 4-β-جالاكتوسيداسي (β-غال) يحفز على أن التحلل من β-جالاكتوسيديس (مثل اللاكتوز) إلى السكريات الأحادية (الجلوكوز واللبن)5. الركيزة الأكثر استخداماً هو العاشر-غال (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)، غليكوزيد الذي هو تحلل من β-جالاكتوسيداسي نشأ عنه 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole واللبن. الأول هو تتأكسد في ديمر، عندما تستخدم جنبا إلى جنب مع البوتاسيوم فيري-وتنتج فيرو-السيانيد، مميزة غير قابلة للذوبان، ويعجل باللون الأزرق (الشكل 1)6.
بدأت الجينات لاكز لاستخدامها كأحد جينات مراسل منذ أكثر من ثلاثين عاماً7،8. عادة، يتم إدراج لاكز المتلقين للمعلومات من المروجين الذاتية مكان الإطار القراءة المفتوحة، حيث يمكن استخدامه في الثقافة البكتيريا والخلية لتصور الخلايا التي تحتوي على إدراج خاصة، وكذلك في الحيوانات المحورة وراثيا كتتبع من الذاتية أنماط التعبير الجيني أثناء التنمية9. وفي هذا الصدد، التصور من β-جالاكتوسيداسي النشاط على نطاق واسع استخدمت في المورفولوجية لفهم العمليات الإنمائية والخلوية من خلايا مفردة لكل الأنسجة. الوراثة المورفولوجية لصالح توليد خطوط مستقرة فيه بناء عنصر ف معدلة تحتوي على الجينات مراسل لاكز إدراج المواقع في الجينوم عشوائياً. وهكذا، عندما وضعت تحت تأثير عناصر محسن قد محرك التعبير عن بطريقة محددة أنسجة، مما سمح إجراء تحليل منهجي لأنماط التعبير العديد من الجينات خلال العقدين الماضيين الماضية10. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح استخدام الفئران المعدلة وراثيا لرصد التعبير الجيني لاكز أيضا الكشف عن المورثات جزئ الأحداث حسب لوكسب لجنة المساواة العرقية بوساطة جزئ، والترجمة من المشتقات متحولة الخلايا الجذعية الجنينية في تحليلات تشيميريك 11، مما يسهل التحكم في التعبير لاكز في أنسجة محددة، وكذلك وقتيا. أيضا، في الأجنة كله، الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي قد تنتج أنماط المصبوغة التفاضلية في كثافات مختلفة التي يمكن ملاحظتها مريح عبر مراحل تنموية مختلفة لتحليل التغيرات الزمنية في التعبير الجيني 8،12.
في هذه المقالة، نقدم بروتوكولا لتصور التعبير الجيني عن طريق X-غال تلطيخ في الأنسجة جبل كله في مراحل النمو المبكر للأجنة الماوس. أننا نقدم هذا الأسلوب histochemical كتقنية حساسة للغاية وغير مكلفة التي تفضل كشف دقيق للخلايا المسماة في العينات جبل كله أو على المستوى الخلوي بعد البارافين مضمن الأنسجة أو الأجنة. الأسلوب يسمح للتصور مباشرة من تلطيخ في الأنسجة الماوس مع خلفية الحد الأدنى عند مقارنتها مع أساليب أخرى13.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجين لاكز كولاي قد استخدمت على نطاق واسع من كمراسل في الدراسات المتعلقة بأنماط التعبير الجيني بسبب حساسية عالية وسهولة الاكتشاف. هذا البروتوكول وصف أسلوب كلاسيكي للكشف عن التعبير β-غال استناداً إلى فعل الانزيمية التي من السهل والسريع لأداء وغير مكلفة. يمكن تطبيق هذا الأسلوب أيضا دو…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر “خدمة نسيجية” لمساعدتها التقنية في كارديوفاسكولاريس المركز الوطني للبحوث (المحوسبة بطاقة الهوية الوطني). كما نشكر الدكتور Motoharu سيكي للفئران Mt4-mmpلاكز توفير يرجى، والدكتورة أليسيا زاي أرويو لدعم مشروعنا ولها قراءة نقدية من المخطوطة. ونود أن نشكر بيتر بوني لتصحيح هذه المقالة. وأيده هذا العمل الأوروبي جامعة مدريد عن طريق منحة (# 2017UEM01) منحت إلى C.S.C.
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
Referências
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
