Анализ одной ячейки иммунофенотип и производство цитокинов в периферической крови в целом через массовые цитометрии
Summary
Здесь мы описываем одноклеточных proteomic подход к оценке иммунной фенотипических и функциональных (внутриклеточных цитокинов индукции) изменения в периферической крови в целом проб, анализируется через массовые цитометрии.
Abstract
Цитокины играют ключевую роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний. Таким образом измерение уровни цитокина был в центре внимания многочисленных исследований в попытке понять, четкие механизмы, которые приводят к распаду self-tolerance и последующих аутоиммунных заболеваний. Подходы до настоящего времени были основаны на изучении одного конкретного аспекта иммунной системы (один или несколько типов клеток или цитокинов) и не предложить глобальной оценки сложных аутоиммунных заболеваний. В то время как пациента на основе сыворотки исследования предоставили важные идеи в аутоиммунных заболеваний, они не источником конкретных клеточных цитокинов dysregulated обнаружено. Всеобъемлющий подход одной ячейки для оценки производство цитокинов в нескольких подмножеств иммунных клеток, в контексте «встроенных» пациент конкретных плазмы, циркулирующих факторы, описано здесь. Этот подход позволяет осуществлять мониторинг пациента специфические иммунные фенотип (поверхностных маркеров) и функции (цитокинов), либо в своей родной «внутренних патогенных «болезни штата, или в присутствии терапевтических агентов (в естественных условиях или ex vivo).
Introduction
Аутоиммунные заболевания являются одной из основных причин заболеваемости и смертности, влияющих на 3-8% населения. В Соединенных Штатах, аутоиммунные заболевания являются одной из ведущих причин смерти среди женщин молодого и среднего возраста (возраст < 65 лет)1,2. Аутоиммунные расстройства характеризуются гетерогенных клинической картины и различных базовых иммунологических процессов. Спектр гетерогенности хорошо представлены на различных расстройств, таких как совместное участие в ревматоидный артрит (РА) и неврологические заболевания в рассеянным склерозом (MS). Однако, этот уровень гетерогенности проявляется также в пределах одной расстройства, такие как системная красная волчанка (СКВ): у некоторых больных может представлять с почечной патологией, в то время как другие страдают от гематологические или совместного участия3.
Основные иммунопатогенезе аутоиммунных расстройств зеркала клиническая неоднородность, с участием авто – и гипер активации нескольких подмножеств врожденного и адаптивного иммунных клеток, и сопутствующих dysregulated цитокина производства. В то время как цитокинов играют ключевую роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, понимание их конкретная роль в механизме заболевания оказалась сложной. Цитокины характеризуются Плейотропия (один цитокинов может иметь несколько эффектов на различных типов клеток), избыточности (несколько цитокины могут иметь тот же эффект), двойственность (один цитокинов может иметь про – или анти – противовоспалительное воздействие в различных условиях), и пластичности (цитокинов можно формовать в роль отличается от его «оригинал», в зависимости от окружающей среды)4,5,6. Следовательно уровень населения методы не может различать гетерогенных клеточных реакций на же «цитокинового окружение». Аналогично, исследование образцов, которые сосредоточены на одном конкретном аспекте иммунной системы (типа одну ячейку или цитокинов), не предлагают глобальной оценки всех элементов, участвующих в сложных аутоиммунных заболеваний. В то время как пациента на основе сыворотки исследования предоставили важные идеи в аутоиммунных заболеваний, они не источником конкретных клеточных цитокинов dysregulated обнаружено.
Недавно мы разработали одноклеточных proteomic подход к одновременно оценить несколько типов иммунных клеток и обнаружить их различных цитокинов возмущений в окружении пациента «патогенных» периферийные плазмы крови циркулирующей факторов. Рабочий процесс описан здесь характеризуется использованием образцов нетронутыми периферической крови в целом, в отличие от изолированных периферической крови мононуклеаров (получения). Периферической крови в целом представляет собой наиболее физиологически соответствующих транспортных средств для изучения системных заболеваний иммунной системы, включая 1) не мононуклеарных клеток крови часто участвующих в аутоиммунных заболеваний (то есть, нейтрофилов, тромбоцитов) и 2) плазмы циркулирующих факторы, такие как нуклеиновые кислоты, иммунных комплексов и цитокинов, которые имеют иммунной активации роли. Для захвата «встроенные патогенных «dysregulated цитокина производства, периферической крови, образцы обрабатываются сразу же после ничьей крови (T0, время ноль) и через 6 ч инкубации при 37 ° C (температура тела физиологических) с транспортом белка ингибитор в отсутствие каких-либо экзогенных стимулирования состояния (T6, время 6 ч), обнаружить цитокина производства (накопление, T6-T0), который будет отражать состояние «встроенных» болезнь (рис. 1). Для изучения dysregulated процессы, которые отражают над или под активации сигнальные пути, участвующих в иммунной реакции, отношение к болезни, образцы периферической крови лечение (6 ч инкубации при 37 ° C с ингибитор транспортного белка) с внешними стимулирование условие, которое отражает патогенез болезни, такие как агонисты Toll-как-рецептор (TLR) в случае СКВ (T6 + R848, время 6 часов с 1 мкг/мл R848), для обнаружения цитокина производства, который отражал бы ответ на нуклеиновые кислоты (сравнение T0 против T6 против T6 + R848, рис. 1). Для изучения иммуномодулирующие эффекты доступны терапии ex vivo, как они относятся к точной иммунной dysregulated процессов для конкретных пациентов, образцы периферической крови лечатся ингибитор Як на соответствующих терапевтических концентрация (здесь, 5 мкм ruxolitinib; T6 + 5R, время 6 h 5 мкм ruxolitinib), чтобы обнаружить изменения в состоянии «встроенных» болезнь в ответ наркотиков (T0 против T6 против T6 + 5R, рис. 1). Ингибитор Як был выбран для этого исследования, потому что JAK ингибиторов было показано, чтобы быть успешным в лечении аутоиммунных расстройств, таких как РА.
Одновременно оценить процессы dysregulated, описанные выше в нескольких подмножеств иммунных клеток, образцы периферической крови от СКВ больных и здоровых элементов управления были обработаны как описано выше и проанализированы массового цитометрии. Массовые цитометрии, также известный как цитометрии-время-из-полет, предлагает одноклеточных анализ более чем 40 параметров без вопросов спектральных перекрываются7,8,9. Этот метод использует редкоземельных металлов изотопов в виде растворимых ионов металлов как теги, обязан антител, вместо флуорофоров10. Дополнительные подробности относительно массового цитометрии технологической платформы (то есть, тюнинг и калибровки, приобретение образца) можно найти в Leipold et al. и Маккарти и др. 11 , 12 высокой размерность массового цитометрии позволяет одновременное измерение нескольких цитокинов всей подмножеств врожденного и адаптивного иммунных клеток с одной ячейкой детализации (Таблица материалов).
Текущий обычных клинических и лабораторных параметров часто не чувствительной или достаточно конкретными для обнаружения текущей болезни активности или ответ на конкретные иммуномодуляторы13, отражающие необходимость лучше очертить основные иммунной изменения, которые привод вспышки. Учитывая распространенность цитокиновой регуляции в аутоиммунных заболеваний, имеют множество подходов к лечению, которые используют антитела или небольшой молекулярной ингибиторы ориентации цитокинов или сигнализации белков, участвует в регуляции цитокиновой продукции Недавно появились. В своей основной формат периферической крови аналитический подход, описанный здесь обеспечивает платформу для определения подмножества клеток пациента специфических dysregulated и их аномальные цитокина производства в аутоиммунных заболеваний с системными проявлениями. Эта методология позволяет для персонализации терапевтического выбора конкретных dysregulated цитокины могут быть определены, а специфическое лечение, варианты могут быть испытаны ex vivo для оценки их способности Миллиметроволновая пациента конкретных болезней процесс.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем, Роман, одноклеточных, proteomic подход к одновременно оценить несколько типов иммунных клеток и обнаружить их различных цитокинов возмущений в окружении пациента «патогенных» периферийные плазмы крови циркулирующей факторов. Этот метод использует периферической кров…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Aimee Пью-Бернар за ее интеллектуальный вклад и полезные замечания. Эта работа была поддержана Боттчер фонд Уэбб-Уоринг биомедицинских исследований премии и премии число K23-1K23AR070897 из низ Елена W.Y. Hsieh. Она также была поддержана премии количество K12-HD000850 от Юнис Кеннеди Шрайвер национального института здоровья ребенка и развития человеческого потенциала и Люсиль Паккард для здоровья детей, Стэнфорд CTSA УЛ1 TR001085 и исследование здоровья ребенка Институт Стэнфордского университета.
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
Referências
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
- O’Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O’Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -. A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
