Syftet med denna artikel är att ge en detaljerad beskrivning av rekommenderade procedurer för att utvärdera lungfunktion hos medvetna möss genom dubbel kammare pletysmografi.
Volym luftbyten skapad av en medveten ämne som andas spontant inom en kropp-box är grunden för pletysmografi, en teknik som används för att bedöma icke-invasivt vissa funktioner av andningsfunktionen hos människor också som försöksdjur. Denna artikel fokuserar på tillämpningen av den dubbel kammare pletysmografi (DCP) i små djur. Det ger bakgrundsinformation om metodiken samt detaljerade stegvisa anvisningar att framgångsrikt bedöma lungfunktion i medveten, andas spontant djur på ett icke-invasivt sätt. DCP: N kan användas för att övervaka lungfunktion av flera djur samtidigt, samt för att identifiera förändringar som kan framkallas av aerosolized ämnen under en vald tidsperiod och upprepad sätt. Experiment på kontroll och allergisk möss används häri att påvisa nyttan av tekniken, förklara de associera resultatet parametrarna, samt för att diskutera relaterade fördelar och brister. Sammantaget ger löstagbara giltiga och teoretiskt ljud avläsning som är betrodda att utvärdera funktionen luftvägarna av medvetna små djur både vid baseline och efter utmaningar med aerosolized ämnen.
Den ökande användningen av små djur att modellen mänskliga andningsorganen sjukdomar har uppmanat utvecklingen av tekniker för att kvantitativt bedöma fungerar av det respiratoriska systemet hos dessa djur. För närvarande, är påtvingat svängning tekniken (FOT) erkänd som den mest exakta metoden att bedöma respiratoriska mekanik i smådjur1,2. Dock som sagt av fenotypning osäkerhetsprincipen, handlas vad är vunnit i mätning precision med FOT utanför mot en förlust i noninvasiveness3. Faktiskt, FOT mätningar förvärvas under mycket kontrollerade experimentella förhållanden som nödvändiggör anestesi, trakeotomi eller muntliga intubation, samt mekanisk ventilation; ett scenario långt från verkliga livet.
I situationer där de experimentella krav förbjuda användning av bedövningsmedel eller ring till liten eller ingen avvikelse från djurets naturliga fysiologiska tillstånd, kan dubbel kammare pletysmografi (DCP) övervägas. Som namnet antyder, består en DCP setup av två anslutna styv kammare byggd för att isolera så hermetiskt som möjligt djurets huvud (eller näsa), i främre kammaren, från dess thorax, i den baksida kammaren. Inom setup, djuret är vid medvetande och andas spontant medan att vara fastspända. Eftersom väggarna i kamrarna inte kan expandera eller dra tillbaka, genererar rörelse i luften och-ut djuret en motsvarande men motsatt vågform inne i bakre kammaren, till följd av den komprimering/dekomprimering av omgivande luft. Vågformen på grund av nasala flöde i den främre kammaren och den relaterade till bröstkorgens rörelse i bakre kammaren således separeras och fångas samtidigt. Beroende på inställningen för DCP design, kan dessa vågformer förvärvas med hjälp av antingen tryckgivare eller pneumotachographs till respektive registrera ändringarna i kammare trycket eller luftflöde in-och ut på avdelningar som funktion av tiden. Den senare metoden är mer vanligt nuförtiden.
Medan djurets andning frekvens exakt kan fastställas av någon form av pletysmografi tekniker, är situationen inte densamma för bestämning av tidalvolym och dess relaterade ventilation parametrar (t.ex., det minutventilation, exspiratorisk volym, osv). I motsats till hela kroppen plethysmograph (WBP) tekniken, där djurets tidalvolym uppskattas från rutan signal4,5, ger DCP tekniken korrekta bedömningar av tidalvolymen. Detta är relaterat till direkta förvärvet av djurets bröstkorg rörelse i bakre kammaren, som är proportionell mot förändringar i lungvolym under andning.
Utöver dessa korrekt andningshjälp parametrar (t.ex., tidalvolym, andning frekvens och minutventilation), störningar i form av andningsvägarna cykeln kan också användas att undersöka neuronala aspekter som styr den respiratorisk drive eller respiratorisk reflexer. Ett konkret exempel på att ansökan skulle vara utvärderingen av inhalerade ämnen på övre luftvägarna sensoriska nervceller6irritation potential. Här, bestäms varaktigheten av en paus i början av utandningen med en parameter som kallas slutet-inspiratorisk paus (EIP), även kallad varaktighet bromsning6. Förlängning av denna paus av irriterande ämnen är associerad med stängningen av djurets glottis, orsakar mätbar under inbromsning i den första delen av förfallodag6,7.
En annan viktig fördel med DCP: N är att det ger två validerade och obestridda parametrar som är känsliga för luftvägsobstruktion. En kallas flödet vid mitten av-tidvatten exspiratorisk volym och förkortad EF508,9,10. Det är luftflödet på midway volymen av varje tidvatten andetag under utandning. EF50 utvinns från bröstkorg flöde tracen och således kan mätas utan den främre kammaren (dvs.i en huvud-out-konfiguration). Annan kallas specifika luftvägsmotståndet och är förkortat sRaw11,12,13. Bestämning av sRaw kräver samtidig inspelning av djurets nasal och bröstkorg flöden som det beräknas från tidsfördröjningen mellan dessa separat respiratoriska spår vid tidpunkten noll flöde i slutet av inspiration. Den logik som beskriver grunden som avser denna försening sRaw var expatiated tidigare11. Enkelt uttryckt, föregå förändringar i lungvolym luftrörelser eftersom en tryckgradient behöver utveckla för att driva luftflöde. I ett friskt djur andas lugnt, är denna försening normalt mycket liten. Men, tryckgradienten som krävs för att tillgodose ett visst flöde (t.ex., ett flöde som är tillräckligt för att ge tillräcklig ventilation) påverkas av graden av luftvägsmotståndet. Under bronkokonstriktion, exempelvis är gradient trycket som behövs för att tillgodose ett visst flöde större, vilket innebär att djuret har att arbeta hårdare för att andas. En större lutning av trycket i djurets bröstkorg innebär också att en större del av flödet och-ut i bakre kammaren beror på dekompression/komprimering av luften i bröstkorgen, som är del av den totala bröstkorgens expansion/infällning som är ur fas med den nasala flöden. Det öka motståndet på grund av bronkokonstriktion kommer därmed att öka fördröjningen mellan baksidan och de främre kammarna och ökar därmed sRaw. Lutningen av trycket som driver luftflöde in-och ut i lungan påverkas också av den inledande bröstkorg gasvolymen (TGV). På en större TGV till exempel den expansion/infällning på bröstkorgen som behövs för att generera en viss gradient av trycket är större (helt enkelt eftersom volymen förskjutningen som krävs för att generera en viss gradient av trycket är större), som innebär också att den djur måste arbeta hårdare för att andas. Återigen, dessa extra bröstkorg förskjutningar är de som krävs för att expandera/komprimera luften i bröstkorgen och därmed ur fas med den nasala flöden. Så, en ökad TGV kommer också att öka fördröjningen mellan kamrarna och ökar därmed sRaw. Som kan ses, resultera både bronkkonstriktion och ökad TGV i en viktigare insats för att dra in luft och-ut i lungan. Detta är i huvudsak de fysiologiskt menande av sRaw. Den representerar det arbete som krävs för andas5,14.
Det är således viktigt att förstå att två skilda faktorer påverkar sRaw: luftvägsmotståndet och TGV. I själva verket kan sRaw uttryckas som en produkt av luftvägsmotståndet och TGV11. Medvetna djur kan ändra sin TGV vid kommer, anpassa sin ventilation till en viss miljö. Under sådana förhållanden, där djurets naturliga fysiologiska tillstånd är oförändrat, är det således omöjligt att urskilja om en förändring i sRaw härrör från en ändring luftvägsmotståndet, från en förändring i TGV eller från en blandning av två. Det rekommenderas därför att komplettera DCP utvärderingen med mer invasiva mätningar av respiratoriska mekanik och/eller lungan volymer, som dem som tillhandahålls av FOT1,15.
Hittills har har löstagbara använts i olika forskningsansökningar. Tekniken kan användas med eller utan huvud kammaren att kvantitativt och utvärdera noggrant effekten av olika ämnen, såsom farmaceutiska ämnen, allergener, irriterande eller andra mediatorer, på lungfunktion i medvetna små djur 16,17,18. Den främre kammaren kan också användas som en exponera kammare aerosolized ämnen eller varierande gas koncentrationer (hypoxi, hyperkapni, etc.)19. Bekvämt, det gör att man samtidigt mäta de akuta effekterna av dessa exponeringar. I själva verket är en av de vanliga användningsområdena för DCP: N att bedöma graden av lyhördhet för aerosolized metakolin i olika modeller av luftvägssjukdomar20,21,22,23, 24 , 25.
Även om DCP tekniken är till synes okomplicerat, skulle vissa praktiska utmaningar kunna avskräcka oerfarna användare eller försämrar noggrannheten och reproducerbarheten för resultaten. Detta dokument ger en detaljerad beskrivning av rekommenderade procedurer för att framgångsrikt rekord andningsfunktionen av DCP i medvetna, återhållen, spontant andning möss. Beskrivningen är specifik för den angivna utrustningen (se Tabell för material). Nyttan och värdet av löstagbara demonstreras också i en gemensam modell av pulmonell allergisk inflammation i två stammar av möss som testas vid baslinjen och i svar på aerosolized metakolin.
Förmågan att mäta lungfunktion hos medvetna djur är klart motiverad i respiratorisk forskning. I allmänhet är DCP: N en intressant metod att utvärdera funktionen ventilation av det respiratoriska systemet i medvetna och andas spontant djur26. Mer specifikt slår löstagbara eller dess huvud ut variant, ofta en avvägning mellan kvaliteten på informationen och önskad grad av invasivitet3 (tabell 2). Tekniken kan anpassas till olika arter (t.ex. mus, råtta, marsvin) eller djur storlekar och kan användas i många forskningsansökningar. Det är särskilt användbart för att bedöma många djur på en gång i en parallell studiedesign, att övervaka lungfunktionen på upprepad sätt och att fånga kineticsen av svar över tid. Dessutom tekniken är enkel och kan läras i relativt god tid. I detta dokument, ett protokoll som sysselsätter DCP mätningar i möss användes som ett exempel för att beskriva de praktiska aspekterna av denna återhållsamma pletysmografi teknik också för att diskutera de kritiska steg och relaterade resultat.
När du arbetar med medvetna djur, är det viktigt att kontrollera villkoren i den omgivande miljön (t.ex., tyst rum med ett begränsat antal personer eller aktivitet) för att generera reproducerbara resultat. Eftersom restrainers kommer i olika dimensioner, är det viktigt att börja med lämplig storlek så att andningen rörelserna är oberörd. Det är också bra och ofta krävs att vänja djuren till experimental set-up och förfaranden, som det är väl etablerat i möss att besöksförbud påverkar andning frekvens12. Beroende på experimentell design eller villkor, kan flera sessioner av inkrementella varaktigheterna behövas. Slutligen är ger tid i början av ett experiment för djuren att justera rum förändring och nödvändig hantering en enkel fråga som visat sig vara effektiva för att andningsmönstret är konsekvent regelbunden och avslappnad vid baslinjen. Arbeta under förhållanden där djuren är bekväma, välanpassade och lugn kommer också att gynna avseende resultatet variabilitet och kvalitet. Det begränsar också någon stressinducerade version av katekolamin, vilket kan öka luftvägarna kaliber och dämpa en inducerad bronkokonstriktion.
Det är viktigt att förstå att det finns ett behov att skilja så hermetiskt som möjligt nasal och bröstkorg flöden. Beroende på systemet eller arter studeras, kan tätningsmekanism variera i form såväl som i effekt. I den löstagbara vi beskrivs häri, skapas tätningen mellan djurets nos och besöksförbud enheten. Vid bedömningen av lungfunktion av DCP, är det också viktigt att ge en tillräcklig och kontinuerlig bias flöde, som en minskning av nivån av syre tillgängligt för djuret kommer att resultera i signifikanta effekter. Med hänsyn till välbefinnandet hos djur i fasthållning begränsar benägenheten för luftläckage skapad av agitation och maximerar därmed kvaliteten på data. Contrastingly, ett avbrott i försegla kommer att resultera i antingen avvisade datamängder eller en underskattning av vissa parametrar.
Dessutom för att aktivera separat registrering av nasala flöde signalen, används den head avdelningen vanligtvis att utsätta djuret för aerosolized ämnen. Som illustreras i denna artikel, kan detta utnyttjas för att utföra ett bronchoprovocation test för att påvisa olika grader av lyhördhet. I sådana experiment, justera spänna av testade koncentrationerna kan behövas beroende på art, stam, eller sex djur studeras. Som tidigare visats8,9,10,27visar nuvarande resultaten att metakolin-inducerade förändringar i sRaw korrelerade väl med invasiv FOT mätningar av luftvägsmotståndet. Resultaten visar också att DCP tekniken inte är lika känslig som FOT för sin förmåga att upptäcka respiratoriska dysfunktion och identifiera en förändrad svar lokaliserade inom de lägsta delar av lungan (lungvävnad eller små perifera luftvägar) . Eftersom djurets airways är intakt, kan närvaron av de övre luftvägarna, som står för den största delen av det totala respiratoriska motståndet till luftflöde28, påverka aerosol spridning och nedfall i tillägg att dämpa bidraget från nedre luftvägarna att en mätning. Tabell 3 sammanfattar andra skillnader mellan DCP tekniken och FOT. Slutligen, medan det skulle vara teoretiskt möjligt att uppskatta djurets totala luftvägsmotståndet (inklusive övre luftvägarna) från en mätning av sRaw, det är allmänt rekommenderas att komplettera DCP utvärderingen med en invasiv mätmetod som den FOT29 att få direkta mätningar av detaljerade respiratoriska mekanik. Beroende på syftet med studien, kan mätningar av övre luftvägarna motstånd också anses vara30,31,32.
Slutsats
På grund av dess begränsade grad av invasivitet är DCP: N en teknik som kan uppfylla ett viktigt behov i respiratorisk forskning. Det ska kunna ge korrekt avläsning av ventilation mönster i medvetna djur samtidigt med några obestridda index av luftvägsobstruktion. Den information som erhålls också verkligen kompletterar som från mer invasiva metoder.
The authors have nothing to disclose.
SML stöds av en STUDENTTILLVARO av kanadensiska institut för hälsa forskning, MG stöds av ett stipendium från respiratorisk hälsa nätverket av FRQS (Fonds de recherche du Québec – Santé) och YB är en forskning lärd från FRQS.
FÖRFATTARNAS BIDRAG
Alla författare bidragit till befruktningen av manuskriptet och/eller video. SML och LD insamlade data. SML, LD, YB, DM, DB och AR bidragit till analys, generering av siffror och manuskript skrivande. YB, AR, KL och MG var inblandade i förbereda video skriptet. Pjäsen spelades av YB, KL och MG.
Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
Phosphate buffered saline | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
House dust mite extract | GREER | 290902 | HDM |
DCP complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
iox software | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
flexiVent FX complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |