Formålet med denne artikel er at give en detaljeret beskrivelse af de anbefalede procedurer til at evaluere respiratoriske funktion i bevidst mus ved dobbelt-kammer plethysmography.
Air volumen forandringer skabt af en bevidst vejrtrækning spontant inden for en krop boks er på grundlag af plethysmography, en teknik, der anvendes til ikke-invasivt vurdere nogle funktioner af den respiratoriske funktion hos mennesker og forsøgsdyr. Denne artikel fokuserer på anvendelse af dobbelt-kammer plethysmography (DCP) i små dyr. Det indeholder baggrundsoplysninger om metoden samt en detaljeret, trinvis fremgangsmåde med succes vurdere respiratoriske funktion i bevidst, spontant vejrtrækning dyr i en ikke-invasiv måde. DCP kan bruges til at overvåge den respiratoriske funktion af flere dyr i parallel samt identificere forandringer som følge af aerosolmaterialer stoffer over en valgte tidsperiode og gentagne måde. Forsøg på kontrol og allergisk mus anvendes heri til at påvise nytten af teknikken, forklare de tilknyttede resultat parametre, samt for at diskutere de dermed forbundne fordele og mangler. Samlet set giver DCP gyldig og teoretisk set forsvarligt udlæsninger, der kan have tillid til at evaluere den respiratoriske funktion bevidst små dyr både ved baseline og efter udfordringer med aerosolmaterialer stoffer.
Den stigende brug af små dyr til model menneskelige luftvejssygdomme har opfordret udviklingen af teknikker til at vurdere kvantitativt funktioner i åndedrætsorganerne hos disse dyr. I øjeblikket, er tvungen svingning teknik (FOT) anerkendt som den mest præcise metode til at vurdere respiratorisk mekanik i små dyr1,2. Dog, som anført af fænotyper ubestemthedsprincippet, hvad er fået i målingen præcision med FOT handles ud mod et tab i noninvasiveness3. Faktisk, FOT målinger er erhvervet under stærkt kontrollerede forsøgsbetingelser, der nødvendiggør anæstesi, tracheotomi eller mundtlige intubation samt mekanisk ventilation; et scenario langt fra virkelighedens.
I situationer hvor de eksperimentelle krav forbyde brugen af bedøvelsesmiddel agenter eller ring for lidt eller ingen afvigelse fra dyrets naturlige fysiologiske tilstand, kan dobbelt-kammer plethysmography (DCP) overvejes. Som navnet antyder, består en DCP setup af to forbundne stive chambers byggede for at isolere så hermetisk som muligt dyrets hoved (eller næse), i den forreste kammer, fra sin brystkasse, i den bageste kammer. Inden for opsætning, dyret er bevidst og ånder spontant samtidig med at være tilbageholdende. Fordi væggene i afdelingerne ikke kan udvide eller trække, genererer bevægelse af luft og-ud af dyret en tilsvarende men modsatte bølgeform indeni den bageste kammer, som følge af kompression/dekompression af den omgivende luft. Bølgeform på grund af nasal flow i den forreste kammer, og den vedrører de thorax bevægelse i den bageste kammer kan således adskilt og erobrede samtidig. Afhængigt af opsætningen af DCP design kan disse bølgeformer erhverves ved hjælp af et sæt af enten Tryktransducere eller pneumotachographs henholdsvis registrere ændringerne i kammeret pres eller luftstrømmen og-ud for afdelingerne som funktion af tiden. Den sidstnævnte metode er mere almindelig i dag.
Mens dyrets vejrtrækning frekvens kan bestemmes nøjagtigt ved enhver form for plethysmography teknikker, er situationen ikke det samme for bestemmelse af tidalvolumen og dens relaterede ventilation parametre (fx, minutventilation, ekspiratorisk volumen, osv.). I modsætning til hel-krops plethysmograph (WBP) teknik, hvor anslås dyrets tidalvolumen fra box signal4,5, giver DCP teknik nøjagtige vurderinger af tidalvolumen. Dette er relateret til direkte erhvervelse af dyrets bryst bevægelse i den bageste kammer, som er proportionalt med ændringerne i lunge volumen i løbet af vejrtrækning.
Ud over disse nøjagtige respiratorafhængige parametre (f.eks.tidalvolumen, vejrtrækning frekvens og minutventilation), nogle forstyrrelser i form af respiratorisk cyklus kan også bruges til at undersøge neuronal aspekter, der styrer den respiratorisk drev eller respiratorisk reflekser. Et konkret eksempel på denne anvendelse ville være evaluering af inhalerede stoffer på de øvre luftveje sensoriske neuroner6irritation potentiale. Varigheden af en pause i starten af udløb bestemmes her, ved hjælp af en parameter kaldet ende-inspiratory pause (EIP), også kaldet varighed af bremsekraft6. Forlængelsen af denne pause af et irriterende stof er forbundet med lukningen af dyrets glottis, forårsager en målbar periode af opbremsning i den første del af udløb6,7.
En anden vigtig fordel ved DCP er, at det giver to validerede og ubestridte parametre, der er følsomme over for airflow obstruktion. En kaldes strømmen på midten af tidevands ekspirationsvolumen og er forkortet EF508,9,10. Det er luftgennemstrømning ved midway volumen af hver tidevandsenergi ånde under udånding. EF50 er udvundet fra sporingen af thorax flow og kan således måles uden den forreste kammer (dvs., i en hoved-out konfiguration). Anden, kaldes specifikke luftvejs modstand og er forkortet sRaw11,12,13. Bestemmelse af sRaw kræver den samtidige optagelse af dyrets nasal og thorax strømme, som det er beregnet fra tidsforsinkelse mellem disse separate respiratorisk spor på nul flow i slutningen af inspiration. Den logik, der beskriver grundlaget, som vedrører denne forsinkelse sRaw var expatiated tidligere11. Put blot, foran ændringer i lunge volumen luftbevægelse, da en trykgradient behov for at udvikle for at drive luftstrøm. I et sundt dyr trække vejret roligt, er denne forsinkelse typisk meget små. Dog er den trykgradient, der er nødvendige for at rumme et givet flow (f.eks, en flow tilstrækkeligt til at give tilstrækkelig ventilation) påvirket af graden af luftvejene modstand. Under bronchoconstriction, for eksempel, er gradienten af tryk der er nødvendige til at rumme en given flow større, hvilket indebærer, at dyret har til at arbejde hårdere for vejrtrækning. En større graduering af trykket i dyrets thorax indebærer også, at en større del af strømmen og-ud af den bageste afdeling er dekompression/kompression af luft i brystkassen, som er del af den samlede thorax udvidelse/sammentrækning, der er ude af fase med nasal strømmen. Den øgede modstand på grund af bronchoconstriction vil således øge forsinkelse mellem bageste og forreste afdelingerne og øger dermed sRaw. Gradienten af pres, der driver luftstrømmen og-ud af lungerne er også påvirket af den oprindelige thorax volumen (TGV). På en større TGV for eksempel udvidelse/sammentrækning af thorax nødvendige for at generere en given gradient pres er større (simpelthen fordi volumen forskydning, der er nødvendige for at generere en given gradient pres er større), hvilket også indebærer at den dyret har til at arbejde hårdere for vejrtrækning. Igen, disse ekstra thorax forskydninger er dem, der kræves for at dekomprimere/komprimere luft i brystkassen og er dermed ude af fase med nasal strømmen. Så, en øget TGV vil også øge forsinkelse mellem afdelingerne og øger dermed sRaw. Som det kan ses, resultere både bronchoconstriction og øget TGV i en mere vigtigt forsøg på at trække luft og-ud af lungerne. Dette er i det væsentlige den fysiologiske betydning af sRaw. Det repræsenterer det arbejde, der kræves for vejrtrækning5,14.
Det er således vigtigt at forstå, at to forskellige faktorer påvirker sRaw: luftvejene modstand og TGV. I virkeligheden, kan sRaw udtrykkes som et produkt af luftvejene modstand og TGV11. Bevidst dyr kan ændre deres TGV efter forgodtbefindende, at tilpasse deres ventilation til et givet miljø. Under sådanne forhold, hvor dyrets naturlige fysiologiske tilstand er uændret, er det således umuligt at skelne, om en ændring i sRaw stammer fra en ændring i luftvejene modstand, fra en ændring i TGV, eller fra en blanding af to. Derfor anbefales det at supplere DCP evaluering med mere invasive målinger af respiratorisk mekanik og/eller lunge diskenheder, som de leveres af FOT1,15.
Til dato, har DCP været brugt i forskellige forskning applikationer. Teknikken kan bruges med eller uden hoved salen til kvantitativt og vurdere præcist effekten af forskellige stoffer, såsom apoteksagenter, allergener, lokalirriterende eller andre mæglere på respiratoriske funktion i bevidst små dyr 16,17,18. Den forreste kammer kan også bruges som en udsætter kammer aerosolmaterialer stoffer eller varierende gas koncentrationer (hypoxi, hyperkapni, etc.)19. Bekvemt, det gør det muligt samtidig måle akutte virkninger disse engagementer. Faktisk er en af de almindelige anvendelser af DCP at vurdere graden af lydhørhed over for aerosolmaterialer methacholine i forskellige modeller af luftvejssygdomme20,21,22,23, 24 , 25.
Selv om DCP teknik er tilsyneladende enkle, kunne nogle praktiske udfordringer potentielt afskrække uerfarne brugere eller forringe den præcision og reproducerbarhed af resultaterne. Den nuværende papir giver en detaljeret beskrivelse af de anbefalede procedurer til korrekt optage respiratoriske funktion af DCP i bevidst, tilbageholdende, spontant vejrtrækning mus. Beskrivelsen er specifikke for den angivne udstyr (henvises til Tabel af materialer). Den nytte og værdi af DCP er også påvist i en fælles model for pulmonal allergisk betændelse i to stammer af mus testet ved baseline og svar på aerosolmaterialer methacholine.
Evnen til at måle lungefunktion i bevidst dyr er klart begrundet i respiratoriske forskning. Generelt, er DCP en interessant tilgang til at vurdere funktionen ventilation af åndedrætsorganerne i bevidste og spontant vejrtrækning dyr26. Mere specifikt rammer DCP eller dens hoved-out variant, ofte den rette balance mellem kvaliteten af oplysningerne og det ønskede niveau af invasiv3 (tabel 2). Teknikken kan tilpasses til forskellige arter (f.eks. mus, rotter, marsvin) eller animalske størrelser og kan bruges i mange forskning applikationer. Det er især nyttigt at vurdere mange dyr på én gang i en parallel undersøgelse design, til at overvåge den respiratoriske funktion i gentagne måde og fange kinetik af en reaktion over tid. Derudover teknikken er enkel og kan læres i et relativt rettidigt. I det foreliggende papir, en protokol beskæftiger DCP målinger i mus blev brugt som et eksempel til at beskrive de praktiske aspekter af dette tilbageholdende plethysmography teknik samt for at diskutere de kritiske trin og relaterede resultater.
Når du arbejder med bevidste dyr, er det vigtigt at kontrollere betingelserne for det omgivende miljø (fx, roligt værelse med et begrænset antal mennesker eller aktivitet) for at generere reproducerbare resultater. Da restrainers kommer i forskellige dimensioner, er det vigtigt at starte med en passende størrelse, så vejrtrækningen bevægelser er uforstyrrede. Det er også nyttigt og ofte nødvendigt at vænne dyrene til eksperimentel opsætning og procedurer, som det er godt etableret i mus at fastholdende påvirker vejrtrækning frekvens12. Afhængigt af de eksperimentelle design eller betingelser, kan flere sessioner af trinvise varigheder være nødvendig. Endelig er giver tid i starten af et eksperiment for at justere værelse ændringer og nødvendige håndtering dyrene en simpel overvejelse, der viste sig at være effektiv til at sikre, at åndedrætsmønster er konsekvent regelmæssig og afslappet på baseline. Arbejde under forhold, hvor dyrene er komfortable, veltilpasset og roligt vil også gavne resultat variation og kvalitet. Det begrænser også nogen stress-induceret frigivelse af katekolamin, som kan øge luftvejene kaliber og dæmpe en inducerede bronchoconstriction.
Det er vigtigt at forstå, at der er behov for at adskille så hermetisk som muligt de nasale og thorax strømme. Afhængigt af systemet eller arter studerede, kan forsegling mekanismen variere i form såvel som i effektivitet. I DCP vi beskrevet heri, oprettes tætningen mellem dyrets snude og fastholdende enheden. Ved vurderingen af den respiratoriske funktion af DCP, er det også vigtigt at give en tilstrækkelig og vedvarende bias flow, da et fald i niveauet af ilt til rådighed til dyret vil resultere i betydelige virkninger. Under hensyntagen til dyret i Tilbageholderen velvære begrænser tilbøjelighed for luft lækager lavet af agitation og maksimerer derved kvaliteten af dataene. Contrastingly, en banebrydende i seglet vil resultere i enten afviste datasæt eller en undervurdering af nogle parametre.
Desuden hvis du vil aktivere separat registrering af nasal flow signal, bruges hoved salen typisk til at udsætte dyret til aerosolmaterialer stoffer. Som illustreret i denne artikel, kan det blive udnyttet til at udføre en bronchoprovocation test for at vise forskellige grader af lydhørhed. I sådanne forsøg, justere rækken testet koncentrationer kan være nødvendigt afhængig af art, stamme eller sex af dyrene studerede. Som tidligere påvist8,9,10,27viser nuværende resultaterne, at de methacholine-inducerede ændringer i sRaw korreleret godt med invasive FOT målinger af luftvejene modstand. Resultaterne viser også, at DCP teknik ikke er så følsomme områder som FOT for sin evne til at opdage respiratorisk dysfunktion og identificere en ændret svar lokaliseret inden for de nedre rum af lunge (lungevæv og/eller små perifere luftveje) . Da dyrets airways er intakt, kan tilstedeværelsen af de øvre luftveje, som tegner sig for den største del af den samlede respiratoriske modstand til luftstrømmen28, påvirke aerosol distribution og deposition desuden til at dæmpe bidrag fra de nedre luftveje for en måling. Tabel 3 opsummerer andre forskelle mellem DCP teknik og FOT. Endelig, selv om det ville være teoretisk muligt at anslå dyrets samlede luftveje modstand (herunder øvre luftveje) fra en måling af sRaw, det er generelt anbefales at supplere DCP evaluering med en invasiv måling teknik som FOT29 at opnå direkte målinger af detaljerede respiratorisk mekanik. Afhængigt af formålet med undersøgelsen, kan målinger af øvre luftveje modstand også betragtes30,31,32.
Konklusion
På grund af dens begrænset grad af invasiv er DCP en teknik, der kan opfylde et stort behov i respiratoriske forskning. Det er købedygtig levere nøjagtig aflæsning af ventilation mønster i bevidst dyr samtidig med nogle ubestridte indekser af airflow obstruktion. De indhentede oplysninger også virkelig supplerer fra mere invasive metoder.
The authors have nothing to disclose.
SMG understøttes af en studentship fra den canadiske institutter for sundhedsforskning, MG er støttet af et legat fra den respiratoriske Health Network af FRQS (Fonds de recherche du Québec – Santé) og YB er en forskning videnskabsmand fra FRQS.
FORFATTERNES BIDRAG
Alle forfattere har bidraget til udformningen af håndskriftet og/eller video. SMG og LD indsamlet dataene. SMG, LD, YB, DM, DB og AR bidraget til dataanalyse, generation af tal og manuskriptet skrives. YB, AR, KL og MG var involveret i udarbejdelsen af den video script. Stykket blev udført af YB, KL og MG.
Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
Phosphate buffered saline | Multicell | 311-506-CL | PBS 10X |
House dust mite extract | GREER | 290902 | HDM |
DCP complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
iox software | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES | ||
flexiVent FX complete system | SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES |