פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

הערה: כל זני, ריאגנטים הנדרש עבור העבודה המתוארות הפרוטוקולים הבאים, ספקים המפורטים בטבלה של חומרים. 1. תרבות של יתוש הזחלים ומבוגרים הערה: חרקים זנים רגישים של יתושים זמינות מתוך מאגר הפניה ריאגנט ומחקר מלריה. מומלץ זנים הם כדלקמן: Aedes aegypti ליברפול (להעברת) זן, אנופלס gambiae זן: קיסומו בקניה (KISUMU1), quinquefasciatus כולכית יוהנסבורג (יוהנסבורג) זן. מחזור התרבות יתוש הזחלים מביצים בליל 12 שעות ביום/12 h ב- 28 ° C ו 75-85% לחות יחסית (RH) במגשי פלסטיק 25 ס”מ על 40 ס”מ (~ 400 הזחלים למגש) כפי שתואר על ידי Nuss,29. להאכיל את הזחלים גרביל הקרקע (aegypti א ו- An. gambiae) או מזון לדגים פתית (quinquefasciatus ג). עבור מבחני דרגות זחל, לאסוף את הזחלים בשלב השלישי זחל (L3) לחלל. אחורי היתושים הבוגרים מן הגלמים זה הועברו כוסות פלסטיק, מקום בתוך 20 L ארגזים מפלסטיק insectary בתנאים שתוארו לעיל. לשמור על יתושים על פתרון 20% סוכר כמתואר29. לאסוף מבוגרים-הופעתה פוסט 3-5 ימים. 2. זחל Assay קשר (מינון נקודה בודדת או מינון תגובה Assay) הערה: וזמינותו יכול להתבצע עם בדיקות, הביוכימיה שאינם מסיסים במים או דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), ובלבד הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד בבארות הבדיקה לא יעלה על 1%. ממיסים חלופיות עשויה להיות אופציה, אבל זה חיוני לאשר הראשונה כי הריכוז הסופי אינו גורם יותר מ- 10% תמותה-72 h פוסט החשיפה. ניתן לבצע את הבדיקה בנקודה אחת במינון או מינון תגובה וזמינותו. אם ביצוע האחרון, מומלץ לבחון את מגוון של ריכוזי (מינימום של חמישה), פורש את ה LC הצפוי50. תווית הבארות של צלחת 24-ובכן ברור רקמות כמוצג באיור1. להכין פתרון מניות של הכימיה מבחן צינור 1.5 מ. שוקל כל כימיה באמצעות איזון האנליטי, וכן בהתאם למאפייני מסיסות, להשעות מחדש ב- ddH סטרילי2O, דימתיל סולפוקסיד או אחרים ממס אורגני מתאים של בחירה (ראה איור 2).הערה: חישובים צריך לקחת בחשבון את הטוהר של הכימיה. לדוגמה, עבור כימיה זה 99% טהורים, להמיס mg 10.1 ב- 1,000 µL של אצטון להשגת פתרון 1%. חותם עם הסרט פרפין ולאחסן ב-20 ° C. לקבוע את הריכוז הסופי של הכימיה מבחן זה יוערך ולהכין דילולים טורי מהפתרון מניות בהתאם, באמצעות הממיס המתאים.הערה: ריכוז ונפח של כימיה, הממס ניתן לחשב באמצעות הנוסחה C1* V1= C2* V2 איפה C1= ריכוז מדגם 1, C2= ריכוז מדגם 2, V1= נפח של דוגמה 1 ו- V2= נפח דגימה 2. ראה את החישובים בדוגמה המוצגת באיור 2 , טבלה 1. להכין פתרון מניות 10 מ מ דילולים טורי ככל הנדרש כדי להשיג ריכוזי המבחן הרצוי (טבלה 1B). באמצעות פיפטה של העברת פלסטיק רחב נשא, להעביר את הזחלים L3 חמש הטוב של צלחת בדיקת תרביות רקמה; L3 הזחלים ניתן לזהות על ידי אורך (~ 2.5-3.5 ממ) ואת הראש קפסולת רוחב ~ 0.025 mm24. בעדינות להסיר את המים עם פיפטה 1 מ”ל והחלף האחסון הרצוי של ddH2O (ראו להלן). אני חוזר כדי להשיג n = 4 משכפל טכני לכל טיפול (קרי, 20 הזחלים הכולל לכל טיפול). להוסיף נפח מתאים של בדיקת כימיה לכל אחת מארבע בארות שכפל בצלחת 24-ובכן הבדיקה, מערבולת בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ערבוב אחיד של הכימיה. מקם את הצלחת בחדר הבדיקה או גידול בתנאים קבועים (למשל, 25 ° C ו ~ 75-85% לחות יחסית מומלץ, ו- h אור/12 12 שעות כהה מחזור במידת האפשר).הערה: עבור הפארמצבטית בין ניסויים, ודא מבחני העוקבות מתבצעות תחת באותם תנאים סביבתיים. לרשום את מספר הזחלים המלח/לא מגיב היטב כל-30 דקות, 1, 1.5, 2, 3, 24, 48, 72 שעות לאחר חשיפה (או נקודות זמן חלופי) בגיליון הציון (טבלה 2). טפח בעדינות את הצד של הצלחת. אם אין תנועה נצפית, לגעת בעדינות הזחל עם קיסם סטרילי. ציון הזחלים לא מגיבים הקשה/מגע כמו “מתים”.הערה: פנוטיפים התנהגותיים מורפולוגיים אחרים עלולים להיות שנצפו, ניתן להקליט. תקן בקרת לתמותה באמצעות הנוסחה של אבוט ששונה במידת הצורך, כדלקמן:התמותה (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),איפה X = את אחוזי תמותה בשיעור של מדגם שטופלו, ו- Y = את אחוזי תמותה בשיעור של הפקד. גרף תוצאות היסטוגרמה או עקומת לוגריתמי באמצעות תוכנה של בחירה כגון גרף-pad פריזמה 6 או דומה, לחשב את ערכי ריכוז קטלני (LC) ביחס הפקד. חזור על וזמינותו באמצעות אוסף נפרד של יתושים כדי להשיג n = 3 או יותר ביולוגי משכפל. 3. למבוגרים Assay אקטואלי (מינון נקודה בודדת או מינון תגובה Assay) הערה: וזמינותו אקטואלי למבוגרים מתנהל באמצעות אצטון כמו הממס. ממיסים חלופיות עשויה להיות אופציה, אבל זה חיוני לאשר הראשונה כי הריכוז הסופי אינו גורם יותר מ- 10% התמותה ב 48 שעות פוסט החשיפה. ניתן לבצע את הבדיקה כפי יחיד הצבע במינון או מינון תגובה assay והיא משמשת כדי לקבוע מנה קטלנית (LD). אם ביצוע האחרון, מומלץ לבחון את מגוון של ריכוזי (מינימום של חמישה), פורש את הצפוי LD50. לקבוע את מספר הבוגרים יתושים הנשי הדרושה כדי להשלים את הבדיקה.הערה: assay במינון נקודת בכימיה יחיד ידרוש מינימום של יתושים 90 (30 עבור הפקד חיובית, 30 עבור הפקד שלילי אצטון-בלבד ו- 30 עבור הכימיה הבדיקה). תרבות 3 בן יום-5 הנשי יתושים בוגרים ולהעביר אל דלי פלסטיק נפרד בפטרת באמצעות סופג את הנוזלים (איור 3). תווית עוז 9 כוסות נייר השם ואת ריכוז של הכימיה הבדיקה. להפריש 10 ס”מ x 10 ס”מ רשת ריבועים, גומיות עבור כל גביע (ראה איור 4). בחר להדברת חרקים קיימים כפקד חיובית (למשל, pyrethroid סינתטי, bifenthrin) והכן פתרון מניות 1% (10 µg/µL) ב אצטון.הערה: חישובים צריך לקחת בחשבון את הטוהר של הכימיה. לדוגמה, עבור כימיה זה 99% טהורים, להמיס mg 10.1 ב- 1,000 µL של אצטון להשגת פתרון 1%. חותם עם הסרט פרפין ולאחסן ב-20 ° C. משתמש באותו הליך כאמור לעיל, להכין פתרון מניות של הכימיה הבדיקה.הערה: בדיקות המבחן רבים, הביוכימיה הן מאוד יציב, פתרונות רצוי לבצעו טריים בכל פעם התכולה יוצאת מבוצעת. להכין דילולים טורי של הפקד חיובי ולבדוק בדיקות, הביוכימיה מפתרונות מניות, כפי שמוצג באיור 5 באמצעות 20 מ ל זכוכית בקבוקונים בעבר שטפה עם אצטון. נקה מזרק זכוכית 1 מ”ל עם אצטון, למלא עם אצטון ולאבטח בהמיקרו-המוליך מותאם כדי לספק נפח של 0.25 µL. עבודה בקבוצות של עשרה, הסר 3 – 5 – בן יום יתושים למבוגרים נקבה מן הכלובים באמצעות של העצמות, עזים ומתנגד עבור עד חמש דקות ב 4 ° C במקרר או על קרח. העברה הבא, יתושים פטרי, המקום על הקרח עד 10 דקות. עובד מהר, להסיר נקבה יחידה עם פינצטה בסדר, חלות µL 0.25 של פתרון מבחן בית החזה הגבי באמצעות המיקרו-המוליך את המזרק. לאשר מסירת כימיה באמצעות התבוננות באמצעות מיקרוסקופ ויבתר כדי להבטיח כל יתוש מקבל נפח מתאים של בדיקת כימיה. להעביר את היתוש כוס נייר שכותרתו נח על קרח, וחזור תשע פעמים כדי להשיג n = 10 יתושים שטופלו. חותם את היתושים בגביע עם ריבוע רשת מאובטחת עם גומייה, העברה לתא פלסטיק או גידול בתנאים קבועה של 28 מעלות צלזיוס ו- 75-85% לחות (על 12 שעות בלילה h יום/12 מחזור עדיפה). חזור על הניסוי הנ ל פעמיים כדי להשיג n = משכפל טכני 3 (קרי, 30 סה כ יתושים) לכל קבוצה טיפול או פקד. חזור על שלבים 3.7-3.10 קודם עם הכימיה מבחן ולאחר מכן הפקד חיובי.הערה: פקד שימושי אחר כדי לכלול אם יתושים מספקת זמינות היא “ריק” של 30 ומורדמת יתושים שאינם מקבלים מבחן בכימיה או הממס. לרשום את מספר יתושים “המלח/לא מגיב” 30 דקות, 60 דקות, 2, 24 ו 48 שעות לאחר חשיפה (או נקודות זמן חלופי) משתמש ב’גיליון הציון (טבלה 3). ציון יתושים כהגדרתו “המלח/לא מגיב” אם הם מראים חוסר תנועה, כמו הנחת בצד אחד או על הגב, עם חוסר היכולת לעוף. אם רצונך בכך, לתקן לתמותה שליטה באמצעות הנוסחה של אבוט שהשתנתה כדלקמן:התמותה (%) = (X-Y) * 100/(100-Y),איפה X = את אחוזי תמותה בשיעור של מדגם שטופלו, ו- Y = את אחוזי תמותה בשיעור של הפקד. הצגת תוצאות היסטוגרמה או עקומה מעריכית. עבור assay התגובה מינון, חישוב LD50, LD75 או ערך90 LD הכימיה במבחן ביחס הפקד. חזור על וזמינותו לפחות פעמיים באמצעות קבוצות נפרדות של יתושים כדי להשיג n = 3 או יותר ביולוגי משכפל. 4. למבוגרים Assay מדם (מינון נקודה בודדת או מינון תגובה Assay) לאסוף כ 150 4-5-יום הישן למבוגרים נקבה יתושים, העברת לכלוב נפרד. חזור על להשיג 6 כלובים אם ביצוע וזמינותו התגובה של מנה. להסיר את המקור של סוכר 1-24 שעות לפני ההאכלה וזמינותו. להכין פתרון מניות של הכימיה כמתואר לעיל, והיוו הטוהר של הכימיה (פתרון מניות טיפוסי הוא 80 מ מ במים או מאגר מלח), ולהכין לאחר מכן דילולים טורי במאגר מים/כנדרש. להוסיף 40 µL של כל אחד דילולים µL 960 defibrinated דם ארנב כדי להשיג את הריכוז המבחן הרצוי. החל ממברנה הסרט ליחידה האכלה, חותם עם טבעת גומי. להעביר 1 מ”ל של דם באמצעות פיפטה, לצרף את יחידת הזנה יחידת חימום. בעדינות ספוגית הקרום על פני השטח עם טרי עשה 10% חומצה לקטית הפתרון ואת המקום יחידת הזנה לתוך הכלוב של יתושים בוגרים. לכסות את הכלוב עם בד בצבע כהה או שקית הזבל שחור ולאפשר יתושים להאכיל למשך שעה אחת. חזור על שלבים 4.2-4.4 עד לתום של בדיקת פתרונות והפקד שלילי (דם בלבד). השלמתה של האכלה, במקום דליים בגיל 4 ° C במקרר במשך 5 דקות כדי עזים ומתנגד יתושים. להסיר את היתושים זכר-fed היתושים הנשי, לספור, להקליט את המספר הכולל של האכלת והאכילה חלקית יתושים בבדיקה של הבטן. שומרים על היתושים הנשי מוזן באופן חלקי, באופן מלא, מכוון למינימום 50 יתושים דם-fed למנה. להעביר דליים תא פלסטיק או גידול בתנאים קבועה של 28 מעלות צלזיוס ו- 75-85% לחות (על 12 שעות בלילה h יום/12 מחזור עדיפה). להקליט את המספר הכולל של יתושים מתים/לא מגיב-0.5, 1, 1.5, 2, 24, 48, 72 h (או חלופי בזמן נקודות לפי הצורך) את הציון באמצעות גיליון (טבלה 4). על השלישי היום פוסט דם ההזנה, להציג את גביע של ביצה לתוך הכלוב ולאסוף ביצים על פני תקופה 72 h. לספור את מספר הביצים המיוצר לכל טיפול תחת מיקרוסקופ ויבתר. לחשב את אחוז התמותה ואת פוריות כפונקציה של המספר הכולל של יתושים סוכן עבור כל קבוצת הטיפול ואת הפקד. תקן לתמותה שליטה באמצעות הנוסחה של אבוט ששונה במידת הצורך. להציג נתונים רעילות ופוריות, היסטוגרמה מגרש או עקומה מעריכית (אם ביצוע וזמינותו התגובה של מינון) באמצעות תוכנה של בחירה. אם ביצוע וזמינותו התגובה של מינון, חישוב LD50, LD75 או ערך90 LD הכימיה במבחן ביחס הפקד. חזור על וזמינותו לפחות פעמיים באמצעות קבוצות נפרדות של יתושים כדי להשיג n = 3 או יותר ביולוגי משכפל.