Summary

식 세포에서 세포내 복제에 대 한의 진 균 abscessus 독성 마커의 식별

Published: September 27, 2018
doi:

Summary

여기, 선물이 식-진 균 abscessus 상호 작용을 공부 하는 두 개의 프로토콜: 세균 세포내 결핍 및 RNA에서 세균 세포내 transcriptome 결정 transposon 돌연변이 라이브러리의 심사 시퀀싱. 두 방법 모두 게놈 장점과 transcriptomic 적응 세포내 박테리아 체력 향상에 대 한 통찰력을 제공 합니다.

Abstract

인간 대 식 세포에 의해 식 균 작용을 저항 하는 기능 및 이러한 셀 안에 번 식 능력은 다른 마저 mycobacteria에서 진 균 abscessus 차별화. 이러한 독성 특성 기본 구조 폐 질환, 낭 성 섬유 증, 기관지 확장 증, 결핵 등으로 취약 한 호스트에서 특히 병원 성 M. abscessus 를 렌더링합니다. 어떻게 환자 M. abscessus 감염 될 불분명 남아 있습니다. 많은 mycobacteria 달리 M. abscessus 환경에서 찾을 수 없습니다 하지만 amoebae, M. abscessus에 대 한 잠재적인 저수지를 나타내는 환경 식 세포 안에 있는 수 있습니다. 실제로, M. abscessus amoebal 식 균 작용에 저항 이며 내 아메바 인생 감염의 실험 모델에서 M. abscessus 독성을 증가 것으로 보인다. 그러나, 약간 그 자체에 M. abscessus 독성에 대 한 알려져 있다. M. abscessus 세포내 생활 이점이 부여 하는 유전자를 해독, M. abscessus transposon 돌연변이 라이브러리의 심사는 개발 되었다. 병렬로 amoebae 공동 문화 후 세포내 Mycobacteria에서 RNA 추출의 방법 개발 되었다. 이 메서드는 검증 되었고 전체 M. abscessus 의 시퀀싱을 허용 세포; 내부 transcriptomes 처음으로, 세포내 생활에 적응 하는 M. abscessus 에 글로벌 보기를 제공합니다. 두 방법 모두 인간의 기도 식민지로 M. abscessus 있도록 M. abscessus 독성 요인에 대 한 통찰력 주세요.

Introduction

속 진 균 종 무해 마저 유기 체에서 주요 인간 병원 체에 이르기까지 포함 되어 있습니다. 결핵균, 진 균 marinum 진 균 ulcerans 등 잘 알려진 병원 성 종 느린 성장의 하위 그룹에 속하는 mycobacteria (SGM). 반면, 급속 한 성장 비율 mycobacteria (RGM) 한 천 매체에 7 일 이내에 보이는 식민지를 형성 하는 그들의 기능에 의해 특징입니다. RGM 그룹 이상 180 종, 비 병원 성 마저 mycobacteria 주로 구성 되어 있습니다. RGM 그들의 호스트와 상호 작용에 대 한 연구는 주로 진 균 smegmatis 에 초점을 맞춘을 이러한 mycobacteria 대 식 세포의 살 균 작용에 의해 빠르게 제거 됩니다 설명.

진 균 abscessus 병원 성 인 간에 게는 드문 RGM 중 하나 이며 다양 한 피부 및 연 조직 감염에서 폐와 전파 감염에 이르기까지 감염에 대 한 책임입니다. M. abscessus 가 간주, 진 균 avium, 함께 낭 성 섬유 증 환자1주 mycobacterial 병원 체.

M. abscessus 에 수행 하는 다양 한 학문이 진이 균은 세포내 병원 체, 세포와 폐에 RGM에서 일반적으로 관찰 되지 않는 피부 섬유 아 세포의 살 균 응답 살아남을 수 있는 처럼 동작 표시 2 , 3 , 4. M. abscessus 게놈 분석 환경 미생물 토양 접촉에서 일반적으로 발견 하는 대사 경로 확인 했다, 식물 및 수 중 환경, 무료 amoebae는 종종 제시5. 그들은 또한 M. abscessus 수집 수 유전 교환에 유리한 틈새에서 수평 한 유전자 이동에 의하여 아마 인수 마저 및 비 병원 성 RGM에 없는 여러 가지 독성 유전자에 어우러진 시연 했다 다양 한 아메바 내성 박테리아입니다.

실험적으로, 첫 번째 눈에 띄는 결과 중 하나는 M. 결핵6에 관해서는 뿐만 아니라 세포에서 세포내 성장의 M. abscessus 관찰 했다. M. abscessus 또한 phagosome apoptosis, autophagy, 감염2에 세포질 저항의 세 가지 필수적인 메커니즘 산성화 저항. 그것은 심지어 M. abscessus 는 phagosome cytosol, 세균성 곱하기2를 선호 수 있습니다 더 많은 영양분이 풍부한 환경 간의 즉각적인 통신을 설정할 수가 표시 되었습니다. 아주 작은 게놈 장점 M. abscessus 소유 또는 세포내 환경에서 생존을 허용 하는 인수에 대 한 알려져 있다. 아메바 coculture 진 균 massiliense7,8로 많은 새로운 아메바 내성 세균의 분리를 허용 하는 효율적인 방법입니다. Amoebae 내에서 증식 하는 능력의 M. abscessus4증가 독성 부여 수 쥐에 M. abscessus 에의 aerosolization 모델에 관찰 되었다. 1 개의 가설은 이다 M. abscessus phagocytic 세포, 다른 비 병원 성 RGM 다른에서 살아남기 위해이 환경 내에서 발생 하는 유전 특성을 개발 했다. 이러한 인수 능력을 확산과 인간의 호스트의 독성 부탁 수 있습니다.

이 보고서에는 도구와 amoebae 환경에서 살아남으려면 M. abscessus 에 수 여 하는 게놈 장점 강조 하는 방법을 설명 합니다. 이 목적에 대 한 M. abscessus transposon 돌연변이의 심사는 처음 설명, Acanthamoeba castellanii 유형 변형, 세포 성장에 대 한 돌연변이 결함 식별 수 있는에. 대 식 세포에서 두 번째 심사는이 결함 인간의 호스트에서 지속 되는지 확인 하, 또한 보고 됩니다. 둘째, 이해 하는 메커니즘은 M. abscessus phagocytic 생활 적응에 무력화 세포 및 동물의 호스트, 특별히 M. abscessus 에 대 한 적응 방법에에서 그것의 독성은 증가 개발, 공동 문화 후 amoebae 존재 하는 내부 amoebal 박테리아에서 총 RNA 추출 허용. 결과적으로, 세포내 생명에 필요한 M. abscessus 유전자의 포괄적인 보기 개발 되었다.

Protocol

1. 라이브러리 심사 테네시 돌연변이 도서관의 건설 Transposon 라이브러리를 가져옵니다.참고:이 실험을 위해 transposon 돌연변이 라이브러리 E.J. 루빈, 하버드 대학 공중 보건의, 보스톤, 미국에서 얻은 했다. 도서관은 phagemid M. abscessus 단일 Tn의 임의 삽입 허용에 도입 된는 M. abscessus 복잡 한 (M. abscessus subsp. massiliense)의 부드러운 임상…

Representative Results

M. abscessus 저항 하 고 대 식 세포와 같은 amoebae 환경 원생 동물의 살 균 응답을 탈출 하는 기능이 있다. M. abscessus 는 악성에 게 쥐4독성 요인을 amoebae, 접촉 성장 될 때 표현 한다. 이러한 방법의 첫 번째 목적은 M. abscessus 그것의 생존 및 곱셈 amoebae 내에 존재 하는 유전자를 확인 했다. 이 위?…

Discussion

M. abscessus 동작은 RGM2에 속하는 다른 mycobacteria 보다 M. 결핵 등 병원 성 SGM의 행동에 훨씬 더 비슷합니다. SGM의 pathogenicity에 핵심 요소 생존 또는 심지어 대 식 세포와 같은 항 원 제시 세포와 수지상 세포 내에서 증식 하는 능력입니다.

M. abscessus 진 핵 phagocytic 세포 내에서 살아남기 위해 그것의 게놈14 의 전체 순서에 의해…

Acknowledgements

우리는 크게 돌연변이의 귀중 한 선물에 대 한 홍보 E.J. 루빈 (하버드의과 대학, 보스톤, 미국)를 인정 도서관과 원고의 교정에 대 한 닥터 벤 마샬 (의 학부, 사우스 햄튼 대학, 영국). 우리가 크게 그들의 재정 지원 (RF20150501377)에 대 한 낭 성 섬유 증 “Vaincre 라 Mucoviscidose” 및 “L’Association 그레고리 Lemarchal” 프랑스 환자 협회를 인정합니다. 우리 또한 감사 국립 기관 연구 (ANR 프로그램 DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), 그리고 지구의 Ile-de-France (도메인 d’Intérêt Majeur 외관 Infectieuses 동부 표준시 Emergentes) V.L m 박사 후 친목을 자금. L. L.는에서 박사 동료는 “Ministère de L’Enseignement Supérieur 동부 표준시 드 라 Recherche”.

Materials

Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

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Citar este artigo
Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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