Summary

貪食細胞における細胞内のレプリケーションの結核菌 abscessusの病原性マーカーの同定

Published: September 27, 2018
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Summary

ここでは、提案する食細胞-結核菌 abscessusの相互作用を調査する 2 つのプロトコル: 細菌の細胞内の欠乏と RNA から細菌細胞トランスクリプトームの決意をトランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングシーケンス。両方のアプローチは、ゲノムの利点と細胞内細菌フィットネスを高めるトランスクリプトーム適応への洞察力を提供します。

Abstract

ヒトのマクロファージによって貪食に抵抗する能力とそのような細胞内増殖する能力は他の腐生抗酸菌から結核菌 abscessusを区別するもの。これらの病原性の特徴は、特に嚢胞性線維症、気管支拡張症、結核などの基になる構造の肺疾患脆弱なホストで、病原性M. abscessusをレンダリングします。M. abscessusと感染になる患者は不明のまま。多くの抗酸菌とは異なりM. abscessus環境で発見されていないが、アメーバ、 M. abscessusの潜在的な貯留層を表す環境食細胞の内部に存在可能性があります。確かに、 M. abscessus amoebal 貪食に耐性があるし、内アメーバ生活の感染実験モデルにおけるM. abscessus病原性を高めるようです。しかし、少しM. abscessus病原性自体について知られています。M. abscessus細胞内生活に利点を付与する遺伝子を解読するには、 M. abscessusトランスポゾン変異ライブラリーのスクリーニングが開発されました。並行して、アメーバとの共培養後抗酸菌の細胞からの RNA 抽出法が開発されました。このメソッドは検証され全体M. abscessusの順序を許可したセル内トランスクリプトーム初めて、 M. abscessus細胞内生活適応上のグローバル ビューを提供します。両方のアプローチは私たちヒトの気道を植民地化するM. abscessusを有効にするとm. abscessus病原因子に洞察力を与えます。

Introduction

属には菌には種無害な腐生生物から人間の主要な病原体に至るまでにはが含まれます。結核菌抗酸菌 marinum マイコバクテリウムの ulceransなどよく知られている病原性の種は、成長の遅いのサブグループに属する抗酸菌 (SGM)。対照的に、急速な成長のサブグループ抗酸菌 (ガンダム) は寒天培地で 7 日以内に目に見えるコロニーを形成する能力によって特徴付けられます。RGM グループは以上 180 種、主に非病原性の腐生抗酸菌で構成します。彼らのホストと RGM の相互作用に関する研究アラビノースイソメラーゼに主に焦点を当てているし、マクロファージの殺菌作用によって、これらの抗酸菌が急速に除去されることを示します。

結核菌 abscessusは人間に病原性のある珍しい RGM の一つです、感染症皮膚および軟部組織感染症から肺や播種性感染症に至るまでの広い範囲を担当。M. abscessusと見なされます、マイコバクテリウム ・ アビウム、とともに嚢胞性線維症患者1のメインの抗酸菌病原体。

M. abscessusに対して様々 な研究を示すこの結核菌が細胞内の病原体、肺および RGM で通常見られない皮膚線維芽細胞とマクロファージの殺菌の応答で生存可能なように動作します。2,3,4. M. abscessusゲノム解析が環境微生物土壌との接触で一般的に見られる代謝経路を発見、植物と水生環境、無料のアメーバが多い5を提示します。M. abscessusは腐生と非病原性の RGM は、おそらく集めるかもしれない遺伝的交流に有利なニッチ市場での遺伝子の水平伝達によって買収に見つかりませんいくつかの病原性遺伝子に恵まれていることをも示しています。様々 なアメーバ耐性菌。

実験的に、最初の顕著な結果の 1 つだったM. abscessus結核6としてもマクロファージの細胞内増殖の観察です。M. abscessusは、ファゴソーム、アポトーシス、オートファジー、感染2細胞の抵抗の 3 つの重要なメカニズムの酸性化も抵抗します。でも、 M. abscessusはファゴソームと細胞質、細菌の増殖2を好むかもしれないより栄養豊富な環境の間の直接通信を確立することが示されています。M. abscessusが所有するか、または細胞内の環境で生存できるように取得してゲノムの利点についてほとんど知られています。アメーバ共は、結核菌 massiliense7,8として多くの新しいアメーバ耐性菌の分離を許可する効率的な方法です。アメーバ内で増殖する能力は、 M. abscessusm. abscessus4に増加病原性を授けることができるマウスでエアロゾル化のモデルで観察されました。1 つの仮説は、 M. abscessusが他の非病原性 RGM とは異なる貪食細胞で生き残るためにこの環境内で発生した遺伝形質を開発していたことです。これらの買収は、感染する能力と人間のホストに対する病原性を好むかもしれない。

このレポートでは、ツールとアメーバの環境で生き残るためにm ・ abscessusに与えられるゲノムの利点を強調する方法について説明します。この目的のためM. abscessusトランスポゾン変異体のスクリーニングは、アカント アメーバ castellanii型株の細胞内増殖の突然変異体の欠陥の識別を可能にするに、まず説明します。マクロファージの二次検診も人間のホストでこの問題が解決しないかどうかを確認する報告されました。第二に、 M. abscessus貪食での生活に適応するために利用されているどのメカニズムを理解する細胞と動物のホスト、 M. abscessus用メソッドに対する病原性は増加開発,共培養後アメーバの存在下で amoebal 内の細菌からの総 RNA の抽出を許可しています。結果として、細胞内の生活に必要なM. abscessus遺伝子の包括的なビューが開発されました。

Protocol

1. ライブラリのスクリーニング Tn変異ライブラリーの構築 トランスポゾンのライブラリを取得します。注: この実験トランスポゾン変異ライブラリーは E.J. rubin 氏は、公衆衛生のハーバード学校、ボストン、米国から得られました。ライブラリは、 M. abscessus複雑な (M. abscessus病菌massiliense) のM. abscessusシングルテネシー州のラ…

Representative Results

M. abscessusに抵抗し、殺菌反応マクロファージやアメーバなど環境原生動物の脱出機能があります。M. abscessusはなる劇毒性のマウス4病原因子、アメーバと接触して育てられたときを表しています。これらのメソッドの最初の目標は、 M. abscessusの生存とアメーバ内で増殖可能で現在の遺伝子を識別するためにだった。 <p class="jove_…

Discussion

M. abscessusの動作は、はるか RGM2に属する他のマイコ バクテリアよりも結核などの病原性の SGM の動作に似ています。SGM の病原性に重要な要素は、マクロファージなどの抗原提示細胞と樹状細胞内であっても乗算または存続する能力です。

M. abscessusは、真核生物の食細胞内で生き残るためにそのゲノム14の合計の順序…

Acknowledgements

我々 は大きく変異の貴重な贈り物の広報 E.J. ルービン (ハーバード大学医学部、ボストン、米国) を認めるライブラリ、および原稿の修正のための博士ベン マーシャル (医学部、英国・ サウザンプトン大学)。我々 は大きく金融支援 (RF20150501377) 嚢胞性線維症」Vaincre ラ Mucoviscidose「と”でグレゴリー ・ Lemarchal」のフランス語の患者会を認めます。また地方イルド フランス (ANR プログラム DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) 総合庁感謝 (ドメーヌ水利 Majeur 病気 Infectieuses et 新興階級) V.L m 員を資金調達のため。L ・ L ですから博士研究員、「ミニステール期高等エ デ ラ凝った」。

Materials

Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

Referências

  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N’Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of “Mycobacterium massiliense” sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
  13. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660 (2009).
  14. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  15. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
  16. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii – Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834 (2014).
  17. Thomas, V., Loret, J. -. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
  18. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
  19. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
  20. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, 246-258 (2011).
  21. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121 (2017).
  22. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939 (2018).
  23. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
  24. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
  25. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
  26. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
  27. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
  28. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
  29. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  30. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
  31. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
  32. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
  33. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553 (2016).

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Citar este artigo
Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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