JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

FM-Dye cykling på synapsen: jämföra höga kalium depolarisation, elektriska och Channelrhodopsin stimulering

Published: May 24, 2018
doi:
10.3791/57765
,
1Department of Biological Sciences,Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development,Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Synaptiskt vesikelprotein (SV) cykling är core mekanismen för kommunikationen i nervcellernas synapser. FM dye upptag och utsläpp är det primära sättet att kvantitativt testmetoder SV endo- och exocytos. Här, jämför vi alla stimulering metoder för att driva FM1-43 cykling på Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ) modell synapsen.

Abstract

FM färgämnen används att studera cykelns synaptiskt vesikelprotein (SV). Dessa amfipatiska sonder har en hydrofil huvud och hydrofoba svans, vilket gör dem vattenlösliga med förmågan att reversibelt ange och avsluta membran lipider lipidmonolager. Dessa styryl färgämnen är relativt icke-fluorescerande i vattenhaltigt medium, men införande i den yttre bipacksedeln av plasmamembranet orsakar en > 40 X ökning av fluorescens. I nervcellernas synapser, är FM färgämnen internaliserad under SV endocytos, trafikerade både inom och mellan SV pooler och utsläppt med SV exocytos, som tillhandahåller ett kraftfullt verktyg för att visualisera presynaptiska stadier av neurotransmission. En primär genetisk modell av glutamatergic synaps utveckling och funktion är den Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ), där FM färga imaging har använts i stor utsträckning att kvantifiera SV dynamik i ett brett utbud av muterade villkor. NMJ synaptic terminalen är lättillgänglig, med en vacker samling av stora synaptic knappar som är perfekt för imaging applikationer. Här, vi jämför och kontrast på tre sätt att stimulera den Drosophila NMJ att driva aktivitet-beroende FM1-43 dye upptag/release: 1) bad tillämpningen av hög [K+] att depolariseras neuromuskulära vävnader, 2) sug elektrod motor nerv stimulering till depolariseras presynaptiska nerven terminal, och 3) riktade transgena uttrycket för channelrhodopsin varianter för ljus-stimulerad, spatial kontroll av depolarisation. Dessa metoder har fördelar och nackdelar för att studera genetisk mutation effekter på SV cykeln på den Drosophila NMJ. Vi kommer att diskutera dessa fördelar och nackdelar att bistå vid valet av metoden stimulering, tillsammans med metoderna som är specifika för varje strategi. Utöver fluorescerande imaging, kan FM färgämnen vara photoconverted electron-tät signaler visualiseras med transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att studera SV cykel mekanismer på en ultrastrukturella nivå. Vi erbjuder jämförelser av confocal och elektronmikroskopi imaging från de olika metoderna för Drosophila NMJ stimulering, att vägleda urvalet av framtida experimentella paradigm.

Introduction

Vackert-kännetecknas Drosophila larval neuromuskulära förbindelsen (NMJ) glutamatergic synaps modellen har använts att studera synaps bildning och funktion med ett brett spektrum av genetiska störningar1. Motorneuronen terminalen består av flera axon grenar, alla med många utvidgade synaptic knappar. Dessa rymlig varicosities (upp till 5 µm i diameter) innehåller alla neurotransmission maskiner, inklusive enhetliga glutamatergic synaptiska vesikler (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosoliskt reserven och lätt-releasable pool2. Dessa blåsor docka på presynaptiska plasmamembranet fusion webbplats aktiva zoner (AZs), där exocytos förmedlar glutamat neurotransmitterfrigöraren för trans-synaptiska kommunikation. Därefter hämtas SVs från plasmamembranet via kiss-och-kör återvinning eller clathrin-medierad endocytos (CME) för upprepad exo/endocytos cykler. Den Drosophila NMJ är lättillgängligt och väl lämpad för både isolera och karakterisera SV cykel mutanter. Nya mutationer använder framåt genetiska skärmar, och har lett till identifiering av nya gener kritiska för SV cykel3. Omvänd genetiska metoder börjar med redan kända gener har dessutom lett till förtydligandet av nya SV cykel mekanismer genom en noggrann beskrivning av mutant cykling fenotyper4. Den Drosophila NMJ är nästan perfekt som en experimentell synaptic förberedelse för dissekera SV endocytos och exocytos mekanismer via metoder för att optiskt spår vesikler cykling under neurotransmission.

En rad fluorescerande markörer tillåta visuell spårning av blåsor under cykling dynamics, men den mest mångsidiga är FM dye analoger som syntetiseras först av Mao, F., et al. 5. strukturellt, FM färgämnen innehåller en hydrofil huvud och en lipofila svans ansluten via en aromatisk ring, med en central region ger spektrala egenskaper. Dessa styryl färgämnen partitionera reversibelt i membran, inte ‘flip-flop’ mellan membran broschyrer och så är aldrig gratis i cytosolen, och är långt mer fluorescerande i membran än vatten5. Reversibel införande i en lipid lipidens orsakar en 40-fold ökning av fluorescens6. På nervcellernas synapser bestå klassiska FM dye märkning experiment av badningen synaptic preparatet med färgämnet under depolariserande stimulering att ladda dye via SV endocytos. Yttre färgämne sedan tvättas bort och cykelns SV grips i en kalciumfri ringer-lösning till bild laddade synapserna7. En andra omgång stimulering i ett färgämne-fria bad utlöser FM utsläpp via exocytos, en process som kan följas genom mätning av fluorescens intensitet minskningen. SV populationer från en enda vesikler till pooler som innehåller hundratals blåsor kan vara kvantitativt övervakade6,7. FM färgämnen har använts att dissekera aktivitet-beroende mobilisering av funktionellt distinkta SV pooler och jämföra kiss-och-kör vs. CME cykling8,9. Metoden har ändrats till separat analys framkallat, spontan och miniatyr synaptic cykel aktiviteter (med mycket känslig utrustning för att upptäcka mycket små fluorescens förändringar och minska fotoblekning)10. Analyser kan förlängas till ultrastrukturella nivå genom photoconverting den fluorescerande FM-signalen till en elektron-tät etikett för överföring elektronmikroskopi11,12,13,14 .

Historiskt, bad synaptic preparat i en hög koncentration av kalium (hädanefter benämnd ”hög [K+]”) har varit metoden för val av depolariserande stimulering för att inducera SV Cykling; allt från grodan kolinerga NMJ5, till odlade gnagare hjärnan Hippocampus nervceller15, till Drosophila glutamatergic NMJ modell16,17. Denna hög [K+] metod är enkel, kräver ingen specialutrustning, och är därför tillgänglig för de flesta laboratorier, men har begränsningar för både tillämpning och tolkning av data. En mycket mer fysiologiskt lämplig metod är att använda sug elektrod elektrisk stimulering av nerven4,5,12. Detta synsätt driver aktionspotentialens spridning för direkt stimulering av presynaptiska nerven terminal, och resultatet kan direkt jämföras med elektrofysiologiska analyser neurotransmission funktion13,14, 15, men kräver specialutrustning och är tekniskt mycket mer utmanande. Med tillkomsten av optogenetik har användandet av channelrhodopsin neuronala stimulering ytterligare fördelar, inklusive snäva spatiotemporal kontroll av kanal uttryck med binära Gal4/UAS system20. Detta tillvägagångssätt är tekniskt mycket lättare än sug elektrod stimulering och kräver inget annat än en mycket billig LED-ljuskälla. Här, vi anställer imaging FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) specificiteten etylenedibromid) att både jämföra och kontrastera dessa tre olika stimulering metoder på den Drosophila NMJ: enkel hög [K+ ], utmanande elektriska och nya channelrhodopsin metoder.

Protocol

1. larval lim dissektion Grundligt blanda 10 delar av silikonelastomer bas med 1 del av silikonelastomer härdare från elastomer kit (Tabell för material). Coat 22 x 22 mm glas coverslips med elastomer och botemedel på en värmeplatta på 75 ° c i flera timmar (tills det inte längre klibbig vid beröring). Placera en enda elastomer-belagd täckglas i skräddarsydda plexi glas dissektion kammaren (figur 1, botten) förberedelse för larval d…

Representative Results

Figur 1 visar arbete-flödet för aktivitet-beroende FM färgämnet protokoll. Experimentet börjar alltid med samma larval lim dissektion, oavsett stimulering metod som därefter används. Figur 1a är en schematisk bild av en dissekerade larv, visar den ventrala nerv sladden (VNC), utstrålande nerver och upprepade hemisegmental muskelmönster. VNC tas bort och preparatet badade i en 4 µM lösning av FM1-43 (<strong class="xfi…

Discussion

Hög [K+] saltlösning depolariserande stimulering är den absolut enklaste av de tre alternativen för aktivitet-beroende FM dye Cykling, men sannolikt den minst fysiologiska29. Den här enkla metoden depolarizes varje tillgänglig cell i hela djuret, och så tillåter inte riktade studier. Det kan vara möjligt att tillämpa lokalt hög [K+] saltlösning med en mikropipett, men detta kommer fortfarande depolariseras pre/postsynaptiska celler och sannolikt synaps-associerade…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Broadie Lab medlemmar för bidrag till denna artikel. Detta arbete fick stöd av NIH R01s MH096832 och MH084989 till K.B., och NIH pre gemenskap F31 MH111144 till D.L.K.

Materials

SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22×22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. . Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , (2012).
  28. Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

FM DyeSynaptic Vesicle CyclingNeuromuscular JunctionDrosophila LarvaeHigh Potassium DepolarizationElectrical StimulationOptogeneticsAnti-HRP AntibodyElastomer-coated CoverslipDissectionGluingMotor NerveCalcium-free SalineSuction PipetteMicroelectrode PullerMicro ForgeMicromanipulator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image