シナプスでサイクリング FM 色素: 高カリウムの脱分極、電気とチャネルロドプシン刺激の比較

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部 (NMJ) グルタミン酸作動性シナプスの美しく特徴モデルは、シナプス形成と遺伝的摂動¹の広大なスペクトルを持つ関数の研究に使用されています。モーターニューロン ターミナルは複数の軸索分岐を多く拡大されたシナプス ボタンのそれぞれから成っています。これらの容量の大きい下肢 (最大 5 μ m) を含む制服グルタミン酸作動性シナプス小胞を含む神経伝達機械のすべて (SVs; 〜 40 nm の直径の) ゾル性細胞質の準備で容易に脱着可能なプール²。これらの小胞はシナプス前膜融合サイト アクティブ ・ ゾーン (AZs)、エキソサイトーシスがトランスのグルタミン酸神経伝達物質を仲介でドック-シナプス通信。その後、SVs は繰り返し exo/エンドサイトーシス サイクルのキス-実行のリサイクルやクラスリン依存性エンドサイトーシス (CME) を介して細胞膜から取得されます。ショウジョウバエNMJ は簡単にアクセス可能で、分離して SV サイクル変異体の特性の両方に適しています。前方遺伝スクリーンを使用した新規変異は SV サイクル³の重要な新しい遺伝子の同定につながっています。また、既に知られている遺伝子で始まる逆遺伝学的アプローチは、変異体の表現型⁴をサイクリングの注意説明を通じて新しい SV 循環メカニズムの解明につながっています。ショウジョウバエNMJ はほぼ光学トラック小胞神経伝達中にサイクリングするメソッドを介して SV エンドサイトーシス、エキソサイトーシスのメカニズムを解剖するための実験的シナプス準備として最適です。

蛍光マーカーの範囲ことが力学をサイクリング中に小胞の視覚追跡ですが最も汎用性の高い FM 色素類縁体を f.、真央らによって初めて合成されました。⁵. 構造上、FM 染料を含む水性頭とつながっている芳香環、中部のスペクトル特性を付与と脂溶性尾。これらのスチリル色素膜で可逆的にパーティションはない ‘フリップフ ロップ’ 膜リーフレットの間、ですから、無料、細胞質で、水⁵よりもはるかに多く蛍光膜です。脂質二分子膜へのリバーシブルの挿入は、蛍光⁶40 増加を引き起こします。神経シナプスで古典的な FM 色素標識実験 SV エンドサイトーシスを介して色素をロードする刺激を脱分極中に染付シナプス準備を入浴で構成されます。外部の色素は離れて洗浄し、SV サイクルは読み込まれたシナプス⁷をイメージさせるカルシウム無料リンゲル液で逮捕されました。色素フリー バースの刺激の第 2 ラウンドは、エキソサイトーシス、蛍光強度の減少を測定することによって続くことができるプロセスを介して FM リリースをトリガーします。小胞の数百を含むプールを単一の小胞から SV 集団は、定量的に監視対象^6,7をすることができます。FM 染料は、機能的に異なる SV プールの活動依存的動員を解剖して CME サイクリング^8,9対キス-実行を比較するために使用されています。メソッドは、アッセイ別の誘発、自発的なミニチュアのシナプス サイクル活動 (非常に小さい蛍光変化を検出し、退色を低減する高感度の機器) を¹⁰に変更されています。試金によって拡張できます微細構造のレベルに photoconverting 蛍光 FM 信号伝達電子顕微鏡^{11,12,13,14 の電子密度の高いラベルに}.

歴史的には、高濃度カリウム (以下「高 [K⁺]」という) の入浴シナプス準備サイクリング; SV を誘発する刺激を脱分極の選択の方法をされているカエル コリン作動性 NMJ⁵からまでは、げっ歯類脳海馬ニューロン¹⁵、ショウジョウバエグルタミン酸 NMJ モデル^16,17に培養。この高 [K⁺] アプローチは簡単です、特殊な装置を必要としないとほとんどのラボにアクセスできます制限がありますアプリケーションのデータの解釈。神経^4,5,12吸引電極電気刺激を使用する大いにもっと生理学的に適切な方法です。このアプローチはシナプス前神経直接刺激の活動電位伝搬をターミナル、ドライブおよび伝達関数^{13,14、電気生理学的アッセイに結果を直接比較すること 15}、しかし特殊な装置を必要として技術的にはるかに困難です。チャネルロドプシン神経刺激の使用は、光遺伝学の出現により、バイナリ Gal4/UAS システム²⁰を使用して、チャンネル式のタイトな時空間制御を含むその他の利点することができます。この方法は技術的に吸引電極刺激よりもはるかに簡単です、何も非常に安い LED 光源以上が必要です。ここでは、我々 は FM1 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) ピリジニウム臭化) をして両方比較してショウジョウバエNMJ でこれらの 3 つの異なる刺激の方法の画像を採用して: 単純な高 [K⁺]、電気と新しいチャネルロドプシンのアプローチに挑戦します。