JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Neurociência

FM farvestof cykling på Synapse: sammenligning af høje kalium depolarisering, elektriske og Channelrhodopsin Stimulation

Published: May 24, 2018
doi:
10.3791/57765
,
1Department of Biological Sciences,Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development,Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Synaptic vesikel (SV) cykling er den centrale mekanisme for intercellulær kommunikation på neuronal synapser. FM farvestof optagelse og udgivelse er det primære middel til kvantitativt boltpistoler SV endo- og exocytose. Her, sammenligner vi alle stimulation metoderne til at drive FM1-43 cykling på Drosophila neuromuskulære junction (NMJ) model synapse.

Abstract

FM farvestoffer anvendes til at studere den synaptiske vesikel (SV) cyklus. Disse amphipathic sonder har en hydrofil hoved og hydrofobe hale, hvilket gør dem vandopløselige med evnen til at reversibelt indtaste og afslutte membran lipid dobbeltlag. Disse styryl farvestoffer er relativt ikke-fluorescerende i vandigt medium, men indsættelse i den ydre folder af plasmamembran forårsager en > 40 X stigning i fluorescens. I neuronal synapser, er FM farvestoffer internaliseret under SV endocytose, trafikerede både inden for og mellem SV pools og frigivet med SV exocytose, at levere et kraftfuldt værktøj til at visualisere præsynaptiske stadier af neurotransmission. En primær genetiske model af glutamatergic synapse udvikling og funktion er Drosophila neuromuskulære junction (NMJ), hvor FM farvestof imaging har været udbredt til at kvantificere SV dynamics i en bred vifte af mutant betingelser. NMJ synaptic terminal er let tilgængelige, med en smuk vifte af store synaptic boutons ideel til imaging applikationer. Her, vi sammenligner og kontrast de tre måder at stimulere Drosophila NMJ at drive aktivitet-afhængige FM1-43 farvestof optagelse/release: 1) bad anvendelsen af høj [K+] depolarisere neuromuskulære væv, 2) suge elektrode motoriske nerve stimulation til depolarisere den præsynaptiske nerve terminal, og 3) målrettet transgene udtryk af channelrhodopsin varianter for lys-stimuleret, fysisk kontrol af depolarisering. Hver af disse metoder har fordele og ulemper for studiet af genetiske mutation effekter på SV cyklus på Drosophila NMJ. Vi vil diskutere disse fordele og ulemper ved at bistå udvalg af stimulation tilgang, sammen med de metoder, der er specifikke for hver strategi. Ud over fluorescerende imaging, kan FM farvestoffer være photoconverted til elektron-tætte signaler visualiseres ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi (TEM) for at studere SV cyklus mekanismer på ultrastrukturelle niveau. Vi levere sammenligninger af Konfokal og elektronmikroskopi imaging fra de forskellige metoder til Drosophila NMJ stimulation, til at hjælpe med at guide udvælgelse af fremtidige eksperimentelle paradigmer.

Introduction

Smukt karakteriseret Drosophila larve neuromuskulære junction (NMJ) glutamatergic synapse model er blevet brugt til at studere synapse dannelsen og funktionen med et stort spektrum af genetiske perturbationer1. Motor neuron terminal består af flere axon filialer, hver med mange udvidede synaptic boutons. Disse rummelige varicosities (op til 5 µm i diameter) indeholder alle neurotransmission maskiner, herunder ensartet glutamatergic synaptiske vesikler (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosole reserve og let frigøres swimmingpools2. Disse vesikler dock på de præsynaptiske plasmamembran fusion site aktive zoner (AZs), hvor exocytose medierer glutamat neurotransmitter frigivelse for trans-synaptic kommunikation. Efterfølgende, er SVs hentet fra plasma-membran via kys og Kør genanvendelse eller clathrin-medieret endocytose (CME) for gentagne exo/endocytose cyklusser. Drosophila NMJ er let tilgængelig og velegnet til både isolerer og karakteriserer SV cyklus mutanter. Brug fremad genetiske skærme, har roman mutationer ført til identifikation af nye gener kritisk for SV cyklus3. Desuden har omvendt genetiske tilgange starte med allerede kendte gener ført til udredning af nye SV cyklus mekanismer gennem en omhyggelig beskrivelse af mutant cykling fænotyper4. Drosophila NMJ er næsten ideel som en eksperimentel synaptic forberedelse til dissekere SV endocytose og exocytose mekanismer via metoder til optisk bane vesikel cykling under neurotransmission.

En vifte af fluorescerende markører tillader visuel sporing af vesikler cyklet dynamics, men den mest alsidige er FM dye analoger, som er først syntetiseret af Mao, F., mfl. 5. strukturelt, FM farvestoffer indeholder en hydrofil hoved og en lipofile hale forbundet gennem en aromatisk ring, med en central region giver spektrale egenskaber. Disse styryl farvestoffer partition reversibelt i membraner, ikke ‘flip-flop’ mellem membran foldere og så er aldrig fri i cytosol, og er langt mere fluorescerende i membraner end vand5. Vendbar indsættelse i en lipid tolagede forårsager en 40-fold stigning i fluorescens6. På neuronal synapser består klassiske FM farvestof mærkning eksperimenter af badning i synaptic forberedelse med farvestof under depolariserende stimulation at indlæse farvestof via SV endocytose. Eksterne farvestof er derefter skyllet væk og SV cyklus er anholdt i en calcium-gratis ringetone løsning til billede indlæst synapser7. En anden runde af stimulation i et farvestof-gratis bad udløser FM udgivelse via exocytose, en proces, der kan efterfølges af måling fluorescens intensitet faldet. SV befolkninger fra en enkelt vesikel til puljer, der indeholder hundredvis af blærer kan være kvantitativt overvågede6,7. FM farvestoffer har været brugt til at dissekere aktivitet-afhængige mobilisering af funktionelt adskilte SV pools og sammenligne kys-og-Kør vs CME cykling8,9. Metoden er blevet ændret til separat assay fremkaldte, spontan og miniature synaptic cyklus aktiviteter (med meget følsomt udstyr til at detektere meget små fluorescens ændringer og reducere photobleaching)10. Assays kan udvides til at omfatte de ultrastrukturelle niveau af photoconverting de fluorescerende FM signal i en elektron-tætte etiket for transmissions Elektron Mikroskopi11,12,13,14 .

Historisk set, badning synaptic præparater i en høj koncentration af kalium (i det følgende benævnt “høj [K+]”) har været den foretrukne metode for depolariserende stimulation for at fremkalde SV cykling; lige fra den frog kolinerge NMJ5, til kulturperler gnaver hjernen hippocampus neuroner15, Drosophila glutamatergic NMJ model16,17. Denne høje [K+] tilgang er simpelt, kræver ingen specialiseret udstyr, og er derfor tilgængelig for de fleste labs, men har begrænsninger for både program og data fortolkning. En langt mere fysiologisk passende metode er at bruge suge elektrode elektrisk stimulation af nerve4,5,12. Denne tilgang drev aktionspotentialet formering for direkte stimulering af den præsynaptiske nerve terminal, og resultaterne kan sammenlignes direkte med elektrofysiologiske assays neurotransmission funktion13,14, 15, men kræver specialudstyr og er teknisk meget mere udfordrende. Med fremkomsten af optogenetics har brug af channelrhodopsin neuronal stimulation yderligere fordele, herunder stramme spatiotemporelle kontrol af kanal udtryk ved hjælp af den binære Gal4/UAS system20. Denne tilgang er teknisk meget nemmere end at suge elektrode stimulation og kræver ikke andet end en meget billige LED lyskilde. Her, vi anvender billeddannelse af FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) til både at sammenligne og kontrast disse tre forskellige stimulation metoder på Drosophila NMJ: simple høj [K+ ], udfordrende elektriske og nye channelrhodopsin metoder.

Protocol

1. larve lim dissektion Blandes grundigt 10 dele af silikoneelastomer base med 1 del af silikoneelastomer hærdning agent fra elastomer kit (Tabel af materialer). Coat 22 x 22 mm glas coverslips med elastomer og kur på en varm tallerken på 75 ˚C i flere timer (indtil ikke længere klæbrig at røre). Sted en enkelt elastomer-belagt glas coverslip ind i custom-made plexi glas dissektion salen (figur 1, bund) som forberedelse til larve dissekti…

Representative Results

Figur 1 viser arbejdsgangen for aktivitet-afhængige FM farvestoffet imaging protokol. Eksperimentet begynder altid med den samme larve lim dissektion, uanset metoden stimulation efterfølgende anvendes. Figur 1a er en skematisk af en dissekeret larve, der viser den ventrale nerve ledningen (VNC), udstrålende nerver og gentagne hemisegmental muskel mønster. VNC er fjernet og forberedelsen badet i en 4 µM løsning af FM1-43 (<s…

Discussion

Høj [K+] saltvand depolariserende stimulation er langt den letteste af de tre muligheder for aktivitet-afhængige FM farvestof cykling, men sandsynligvis den mindste fysiologiske29. Denne simple metode depolarizes alle tilgængelige celle i hele dyret, og så tillader ikke styret undersøgelser. Det kan være muligt at anvende lokalt høj [K+] saltvand med en mikropipette, men det vil stadig depolarisere pre/postsynaptiske celler og sandsynligvis synapse-associerede glia<sup…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Broadie Lab medlemmer for bidrag til denne artikel. Dette arbejde blev støttet af NIH R01s MH096832 og MH084989 til K.B., og NIH predoctoral fellowship F31 MH111144 til D.L.K.

Materials

SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22×22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. . Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , (2012).
  28. Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

FM DyeSynaptic Vesicle CyclingNeuromuscular JunctionDrosophila LarvaeHigh Potassium DepolarizationElectrical StimulationOptogeneticsAnti-HRP AntibodyElastomer-coated CoverslipDissectionGluingMotor NerveCalcium-free SalineSuction PipetteMicroelectrode PullerMicro ForgeMicromanipulator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image