Fare modelleri Glomerular hastalığı böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Tüm deneyler UK mevzuat ve yerel etik kurul onay uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan çalışmaları University of Bristol Araştırma Etik Komitesi tarafından kabul edildi. 1. üriner albümin kreatinin oranı (uACR) Not: UACR albümin GFB geçirgenliği değerlendirmek için kullanılır. İdrarda albümin varlığını artan geçirgenliği kreatinin idrar debisi değişimler için kontrol etmek için normalleştirilmiş GFB genelinde gösterir. Albuminuria kronik böbrek hastalığı için ortak bir belirtecidir. İdrar deneysel temel ve düzenli aralıklarla (haftalık için bir kez bir kez aylık) deneysel son nokta kadar toplamak. Fare metabolik kafesleri su ve zenginleştirme diyet ile ayarlayın. Sessiz bir odada 6 h için bireysel kafeslerde fareler (Erkek, yaşlı 6-8 hafta) yerleştirin. Boş kafes üzerinden dönüş fareler düzenli konut ve toplamak idrar için. En az 50 µL gereklidir.Not: Eğer fare verilen süre içinde idrar üretmek değil, başka bir gün daha sıcak bir odada yineleyin. 500 x g 10 dk. toplamak için de idrar idrar santrifüj kapasitesi ve tortu podocyte kaybı değerlendirmek için korumak. -20 ° C’de idrar kısa vadede bu noktada depolar. İdrar 1 x Tris arabelleğe alınmış serum (TBS pH 7.5) adlı bir 1:500 albuminuria şiddetine bağlı olarak 1:10000 seyreltme için % 1 sığır serum albumin (BSA) sulandırmak.Not: Son birim olmalıdır > 400 µL. gelin her zaman doğru seyreltme belirlemek için en iyi duruma getir. Bir fare albümin enzim bağlantılı immunosorbent assay (ELISA) başına üreticinin yönergelerini kullanarak üriner albümin konsantrasyonu ölçmek. Kısaca, oda sıcaklığında 1 h için anti-fare albümin birincil antikor (10 µg/mL 0.5 M karbonat-bikarbonat pH 9,6) 100 µL ile protein bağlama için en iyi duruma getirilmiş ELISA plaka kat. Beş kez ile 1 x TBS artı % 0.05 kuyulardan aşırı antikor yıkama ara (pH 8.0) ve çözüm (1 x TBS % 1 BSA pH 8.0 ile) Oda sıcaklığında gecede engelleme 200 µL ekleyin. Plaka beş kez yıkayın ve standartların 100 µL ekleyin (seri seyreltme: 2000 µg/mL % 1 BSA, pH 8.0 ile 1 x TBS 15.63 µg/ml), boş ve nüsha seyreltilmiş örneklerinde. Oda sıcaklığında 1 h için bırakın sonra plaka beş kez yıkayın. HRP algılama antikor 100 µL her şey (10 ng/mL % 1 BSA, pH 8.0 ile 1xTBS) ekleyin ve 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya. Plaka beş kez yıkayın ve her şey için 100 µL enzim substrat çözeltisi ekleyin. Plaka 15dk için geliştirmek ve reaksiyon 0,18 M sülfürik asit 100 µL ekleyerek durdurmak için karanlıkta bırakın (H2SO4).Dikkat:4 aşındırıcı bu yüzden H2. Bir absorbans 450 plaka okuyarak her örneğinin albümin konsantrasyonu belirlemek nm. Her örnek içinde mevcut albümin ölçmek için standart eğri’yi kullanın. Teknik tekrarlar %5 büyük bir CV değeri varsa, tahlil örnekleri için yineleyin. Alternatif olarak, Elektroforez kullanarak üriner albümin konsantrasyonu değerlendirmek. 4 protein örnek yükleme arabellek x 5 µL idrar 15 µL için ekleyin. Örnekleri 10 min için 95 ° c ısı ve sonra 4- prekast Tris jel yükleyin. Jel 100 V ve leke gecede Coomassie mavi üreticinin iletişim kuralı başına çalıştırın. Jel görüntüleme sonra Dansitometresi kat değişiklik albümin konsantrasyonu denetime göre değerlendirmek için kullanın.Not: hiçbir bantları için beklenen albümin gözlenir, idrar protein konsantrasyonu değerlendirmek ve jöleye eklendi idrar seviyesini ayarlamak. DH2O 1:1, 1:5 ve 1:10 ham idrar örneğinde sulandırmak.Not: Son birim olmalıdır > 70 µL. doğru seyreltme her örneğinin belirlemek için en iyi duruma getir. Kimyasal tahlil başına kiti talimatları kullanarak idrar kreatinin konsantrasyonu ölçmek. Kısaca, kreatinin standartları, boş veya seyreltilmiş idrar nüsha 96 iyi plaka için 20 µL yükleyin. 490 bir absorbans plaka okuyarak her örneğinin kreatinin konsantrasyonu belirlemek nm önce ve sonra asit solüsyonu eklenmesi (dikkat, aşındırıcı; cilt ile temasından sakının).Not: Absorbans değerleri arasındaki farkı kreatinin konsantrasyonu her örnek içinde doğrudan orantılıdır. Standart bir eğri standartın nesil olduğunu. Teknik tekrarlar %5 büyük bir CV değeri varsa, tahlil örnekleri için yineleyin. UACR (µg/mg) oluşturur. Her fare grafik olarak gösterilmesi için temel değeri için verileri normalleştirmek. 2. doku ve kan toplama Not: Böbrek ve glomerular doku yapısal, protein ve mRNA ifade işaretleri böbrek hastalığının değerlendirmek için kullanılabilir. Kan işaretleri up-düzenlenir glomeruli filtrasyon kapasitede bir azalma gösteren böbrek hastalığında olabilir kreatinin gibi böbrek işlevinin değerlendirmek için kullanılabilir. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak: taze % 2.5 oxazolidin 0.1 M sodyum cacodylate (pH 7.3), 1 fosfat tamponlu tuz (PBS), memeli zil’ın çözüm (115 mM sodyum klorür (NaCl), 10 mM sodyum asetat (CH3COONa), 1.2 x %4 paraformaldehyde mM sodyum fosfat (Na2HPO4), 25 MM sodyum bikarbonat (NaHCO3), 1.2 mM magnezyum sülfat (MgSO4), 1 mM kalsiyum klorür (CaCl2), 5.5 mM D (+) glikoz, pH 7,4) % 1 BSA ve 1 x PBS ile.Dikkat: % 2.5 oxazolidin: toksik, derhal, tahriş edici; bir duman dolapta kullanın. 0.1 M sodyum cacodylate: toksik, bir duman kabine kullanımda. % 4 İngiltere’de yılın: sabitleştirici, duman kabine kullanımda Aşağıdaki belgeleri hazırlamak: isoflurane, küçük ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA)-boyalı kan tüpleri, 23-25G iğneler, 5 mL EDTA kaplı şırınga, 10 mL Cam şişe, 10 mL plastik şişeleri, 0.5 mL Plastik tüpler, tek kullanımlık mendil kalıpları, Kuru buz, sıvı N 2, fare cerrahi araçları ve en iyi kesim Orta (OCT). Fareyi fare non-yanıt veren bir isoflurane odası veya terminal anestezi enjekte edilebilir anestetik ajanlar (Fentobarbital, 50 mg/kg gibi eşdeğer yolları kullanarak ayak pedi için bir iğne iğne için varlık tarafından doğrulanmadı derin anestezi altında yer mayi [IP]; Avertin, 240 mg/kg IP), ya da karbondioksit (CO2) çıkması (% 75 CO2/25% O2). Fare ile kardiyak ponksiyon sol ventrikül itlaf ve mümkün olduğunca çok kan toplamak. En fazla 4 saat için kan EDTA kaplı tüp aktarın. Tercih Eğer fare ile servikal yerinden çıkması juguler ven rüptürü değil için alınan bakım ile itlaf. Karın ve buz soğuk 1 x PBS yıkama böbrekler dışarı incelemek. Kortikal glomeruli incelemek için böbrek korteks bir kutup kaldırın ve 1 mm3 parçalar halinde kesin. Derin juxta medüller glomeruli incelemek için aynı tekniği ile medulla dokudan yineleyin. 5 mL % 2.5 oxazolidin çözeltisi içinde cam EM şişe yerleştirin. 4 ° C’de mağazaDikkat: % 2.5 oxazolidin çözüm: toksik, derhal, tahriş edici; bir duman dolapta kullanınNot: işlemi en iyi sonuç için 1 ay içinde. Histoloji için 5 mL % 4 paraformaldehyde 4 ° c 24 h 5 mL % 70 de aktarmak için de bir böbrek kortikal ve juxta medüller glomeruli-ecek var olmak mevcut, emin olmak için ve düzeltme üst üçte kaldırmak alkol parafin içinde katıştırma önce 24 saat.Dikkat: %4 PFA: sabitleştirici, duman kabine kullanımda Ayirt için kortikal ve medüller glomeruli mevcut, doku kalıp ve Ekim ceket içine olacak emin olmak için böbrek, üçüncü sırada yer kuru buz dondurmak ve-80 ° C’de depolamak için Protein ve RNA için yer 3 x 2 mm3 adet böbrek korteks 0.5 mL plastik boru ve ek içine sıvı N2′ dondur. Mağaza-80 ° C’de Uzun süreli doku depolama için RNA, RNA sabitleme çözüm 5 cilt olarak doku yerleştirin ve-80 ° C’de saklarız Glomeruli yalıtımı, kalan böbrek doku kadar dilim ve 5 mL memeli zil’ın çözeltisi % 1 BSA buz ile yerleştirin. Glomeruli hemen elek hazır olun. 3. plazma kreatinin Not: Plazma kreatinin yukarı glomeruli filtrasyon kapasitede bir azalma gösteren böbrek hastalığında düzenlenmiş olabilir. Protokol burada açıklanmayan rağmen kan üre nitrojen (BUN) seviyesi de değerlendirilebilir. Kan örneği ‘ 500 x g 4 ° C’de 15 dakika santrifüj kapasitesi -20 ° C de kısa vadede bu noktada saklanabilecek olan plazma toplamak. 1.11 protokolündeki üriner kreatinin için kimyasal kreatinin tahlil başına yukarıdaki talimatları kullanarak plazma kreatinin konsantrasyonu ölçmek. 490 bir absorbans plaka okuyarak her örneğinin kreatinin konsantrasyonu belirlemek nm önce ve sonra asit solüsyonu eklenmesi.Not: Bu absorbans değerleri arasındaki farkı kreatinin konsantrasyonu her örnek içinde doğrudan orantılıdır. Standart bir eğri standartın nesil olduğunu. Teknik tekrarlar %5 büyük bir CV değeri varsa, tahlil örnekleri için yineleyin. 4. Glomeruli yalıtım Not: Glomeruli bireysel glomeruli ex vivogeçirgenliği, hem de ifade belirli protein ve mRNA işaretleri glomerular hastalığının değerlendirmek için izole. Memeli zil’ın çözüm % 1 BSA ile yerleştirilen böbrek doku almak ve bir standart tekniği13eleme kullanarak glomeruli incelemek. Kısaca, 70 µm (alt), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm ve 425 µm (üst) elek üstünde-e doğru bir cam kabı yığını. Böbrek püre, bir şırınga dalgıç 425 µm kullanarak elek ve % 1 BSA ile buz soğuk memeli zil’ın çözüm kullanarak itme. Böbrek parçaları itilir gibi üst elek kaldırmak ve sonraki aynı şeyi yapmaya devam edin. Tekrar sadece 100 µm ve 70 µm elekler kalır. 100 µm ve 70 µm tarafından muhafaza glomerular hasat aktarım Elekler için 10 mL taze memeli zil’ın çözeltisi % 1 BSA, buz ile.Not: glomeruli mL zil’ın çözüm başına sayısı az ise, glomeruli son iki elekler toplamak için kullanılan zil’ın çözüm hacmini azaltmak. 5 mL glomeruli içine iki ayrı tüp (2.5 mL her) ve 4 ° C’de 10 dakika 1000 x g, santrifüj içeren çözüm de kaldırmak Süpernatant kaldırmak ve ek protein ve RNA ayıklama daha sonraki bir tarihte-80 ° C’de depolamadan önce sıvı N2 glomeruli dondurma. Glomeruli ölçme noktalar glomerular LpA 37 ° C’de bir su banyosunda içeren kalan çözüm yer / Vbenex vivo. İçinde 3 h-böbrek çıkarmadan tamamlayın. 5. glomerular Su geçirgenliği (LpA / Vben) Not: Glomerular LpA / V tahlilben bireysel glomeruli geçirgenliği ex vivo ölçüm hızlı bir tekrarlanabilir bir şekilde sağlar. Bir artış glomerular LpA / Vben GFB, bozulma olan böbrek hastalığı düşündüren olduğunu gösterir. Glomerular LpA ayarla / Vben teçhizat somon ve ark10içinde açıklandığı gibi. Belgili tanımlık kurmak ayrıntılı bir diyagram için Şekil 1 ‘ e bakınız. Aşağıdaki çözümleri hazırlamak: memeli zil’ın çözüm % 1 BSA (pH 7,4) ile ve memeli zil’ın çözüm % 8 BSA (pH 7,4) ile. Her ikisi de 37 ° c sıcak Mikropipetler cam kapiller tüpleri üzerinden çekin (optik yoğunluk: 1,2 mm). 5-8 µm diyafram bahşiş bir mikroskop altında micropipette keserek oluşturmak. Glomerular LpA kullanın / Vben teçhizat Bowman’s kapsül ve emme kullanarak micropipette üzerine borulu parçaları olduğu gibi bireysel glomeruli yakalamak için. Oncometric tahlil ayrıntılı bir özetini somon ve ark10içinde bulunur. Bir kez bir glomerulus yakaladı ve emme micropipette güvenli, kısaca, mikroskop altında glomerulus video kaydı başlar. İlk olarak, 1 BSA zil’ın çözüm glomerulus equilibrate perifusate konsantre % 8 BSA zil’ın çözüm 10 için geçiş yapmadan önce s s. Daha sonra perifusate geri % 1 BSA zil’ın çözüm anahtarı ve durmak belgili tanımlık yazmak. Glomerulus silsin ve fare başına 10-15 glomeruli için işlemi tekrarlayın. Perifusate akış oranları aynı ve hızlı değil sağlamak (10 mL/dak) olarak değil glomerular yapısı deforme etmek için. Glomerular büzülme glomerular birime (Vben) normalleştirilmiş glomerular Su geçirgenliği (LpA) hesaplamak için başlangıç hızını ölçmek. Somon ve ark10analizi ile ilgili detaylı bilgi bulunabilir. 6. periyodik asit Schiff (PAS) leke Not: PAS lekesi glomerular kapiller döngüler Bodrum zarı ve borulu epitel vurgular. Glomerular hücrelerin, mesangial matris ve potansiyel genişleme ve GBM (yani, kalınlaşma ve düzensizlikler) olası değişiklikler ayrıntılı görselleştirme sağlar. 5 µm kalınlık poli-L-lizin kaplamalı slayta adlı bir microtome kullanarak parafin katıştırılmış, PFA-sabit böbrek korteks bölüm. 1 h. sağlamak için 37 ° C’de kuru bölüm herhangi bir kıvrım veya morfolojisi mikroskop altında deforme edebilirsiniz delik içermez. İki kez ksilen kuluçka tarafından slaytlar deparaffinize (dikkat, tahriş edici; duman kabine kullanımda) 3 min için iki kez 0 alkol 3 dakika ve sonra bir kez % 95, % 70 ve % 50 alkol 3 dk her, tüm oda sıcaklığında. DH2O. slaytları yeniden hidrat Periyodik asit çözüm slaytları kuluçkaya (dikkat, tahriş edici; duman kabine kullanımda) (1 g/dL) 5 min ve sonra durulama için çeşitli değişiklikler dH2O. slaytları ile 100 mL dH2O oda sıcaklığında bir kapsayıcı kullanın.Dikkat: periyodik asit çözüm: tahriş edici; duman dolapta kullanın Schiff’ın reaktif slaytları kuluçkaya (Parasoaniline HCl 6 g/M ve sodyum METABISÜLFİT %4 oranında HCl 0,25 mol/L) Oda sıcaklığında 15 dakika. Musluk suyu 5 min için çalışan slaytlar yıkayın. Hematoksilen ile counterstain 3 için iyice musluk suyu 15dk için çalışan slaytlar durulama önce s.Not: Bazı optimizasyon hematoksilen boyama için en uygun zamanı belirlemek için gerekli. 6.2. adımda tersine, deparaffinization protokolü kullanarak slaytları kurutmak. Ksilen ile bitirmek. Hava kuru slaytlar ve bağlama ile montaj ksilen-esaslı kitle iletişim araçları. Işık mikroskobu glomerular yapıları değerlendirmek için 400 X büyütme, görüntü. Aşağıdaki değerlendirmek: kalınlaşma ve GBM usulsüzlükler çöken kapiller döngüler, fibrotik doku, skleroz, hücresel proliferasyonu (endotel, podocyte ve mesangial veya inflamatuar hücre tutam infiltre).Not: glomerular patofizyolojisi kapsamlı bir değerlendirme için başka bir yerde lezyonlarının böbrek olmalıdır değerlendirilmiş, tübüllerin gibi. 7. iletim elektron mikroskobu (TEM) Not: TEM Ultra yapısal anormallikler muayene GBM, podocyte ayak süreçleri ve ışık mikroskobu ile görünür olmayan endotel fenestrations gibi böbrek sağlar. Bu nerede böbrek hasarı çok (yani, hiçbir albuminuria ve önemli yapısal anormallikler) belirgin değildir modellerinde önemlidir. % 2.5 gluteraldehdye – sabit doğranmış böbrek almak ve % 1 osmiyum tetroxide içinde 50 mL 0.1 M cacodylate arabelleği (pH 7.3) ve daha sonra dH2O 50 mL 1 h. Yıkama için (3 x 15 dk değişiklikleri) sonrası düzeltme.Dikkat: % 2.5 oxazolidin: toksik, derhal, tahriş edici; bir duman dolapta kullanın. 0.1 M sodyum cacodylate: toksik, bir duman kabine kullanımda Alkol ile kurutmak ve Araldite reçine embed. 50-100 nm kalınlığı bölümleri kesme ve % 3 (sulu) uranyl asetat ve Reynolds ın götürmek sitrat eriyik ile leke. Çeşitli alanlarda glomerulus 940 X, dijital filmler ele, 1250 X ve 6200 X emin olmak için podocytes, GEnCs, GBM ve mesangium belirlenebilir. ImageJ kör glomeruli çözümlemek için kullanın. Ölçeğin her 6200 X test için bir cetvel gibi bilinen mesafe iki nokta arasında bir çizgi çizerek ayarlayın. Analiz için gidin ve ölçek, nerede hattın uzunluğu-ecek var olmak göstermek piksel olarak ayarlayın. Bilinen mesafe ve ölçü birimleri yazın. Aşağıda listelenen her parametre ölçüm için iletişim kuralları kullanırlar.Not: Bu analiz fare yaklaşık 1 günlük gerektirir. İstatistiksel elektrik, 3 glomeruli 3 fare üzerinden üzerinden ortalama ölçüleri kullanın. GBM için sabit dijital kılavuz (10 x 10) 6200 X test yerleştirin ve GBM nerede kılavuz çizgileri GBM çapraz noktada kalınlığını ölçmek. Bazal podocyte ayak işlem hücre zarı düz çizgi aracını kullanarak endotel hücre zarı için dikey teğet içinde için bazal endotel hücre membran ölçmek. Ortalama ölçüm için her glomerulus üzerinden 10 bireysel ölçümleri belirleyin. Endotel fenestrasyon numarası için 6200 X test mevcut GBM uzunluğunu ölçmek ve GBM uzunluğu birimi başına endotel fenestrations saymak. Ortalama glomerulus başına en az 4 Filmler üzerinden alın. Podocyte için işlem genişliği ayak, sabit dijital kılavuz (10 x 10) 6200 X test yerleştirin. Kılavuz çizgileri çapraz podocyte ayak süreçleri genişliğini ölçmek. GBM buluştuğu ayak işleminin en geniş parçası genişlikte ölçün; yolun podocyte bazal membran tanjantını dik olduğundan emin olun. Ortalama ölçüm için her glomerulus üzerinden 10 bireysel ölçümleri belirleyin. Genişlik yarık podocyte için sabit bir dijital kılavuz (10 x 10) 6200 X test yerleştirin. Kılavuz çizgileri çapraz podocyte yarık diyaframlar genişliğini ölçmek. Bu ayak süreçleri podocyte membran-membran yakın birlikte, her ayak işlem en geniş kısmında nerede noktadır. Ölçüm podocyte bazal membran tanjantını dik olduğundan emin olun. Ortalama ölçüm için her glomerulus üzerinden 10 bireysel ölçümleri belirleyin. Podocyte sayısı için süreçleri, 6200 X test mevcut GBM uzunluğunu ölçmek ve ayak podocyte ayak süreçleri GBM uzunluğu birimi başına saymak. Ortalama glomerulus başına en az 4 Filmler üzerinden alın. Alt-podocyte alanı kapsamının Neal ve arkiçin detaylı yöntemine bakın. 14. 940 X filmler kullanarak, glomeruli anormal yapısını, mevduat ve infiltratlar varlığı için göz göre inceleyin. 8. ayirt Podocyte ve endotel işaretleri için Not: Immunostaining protein ifade kalıplarının glomerular hastalığında daraltabilirsiniz endotel kılcal döngüler gibi görselleştirme sağlar. Kesit önce 2 h için-20 ° C’de donmuş böbrek içeren OCT-kalıp yerleştirin. Böbrek kesme yüzeyi dikkatlice de odaklı doku bölümleri etkinleştirmek için OCT-kalıp alt karşı yerleştirilir emin olun. Bir cryostat kullanarak, Bölüm doku 5 µm kalınlığa üstünde-e doğru poli-L-lizin, slaytlar kaplı.Not: hiçbir kıvrımlar veya delik morfolojisi deforme edebilirsiniz doku bölümünde olduğundan emin olun. Cryostat kaldırılması slaytlar düzeltmek %4 oranında PFA 10 dk. Yıkama için 100 mL ile bir kapta 3 x 5 dk dH2O. slaytlar.Dikkat: %4 PFA: sabitleştirici, duman kabine kullanımda Kullanılan antikor miktarı en aza indirmek için bölümler hidrofobik kalemle çizin. Kuru bölümleri izin vermeyin. Oda sıcaklığında 1 h için çözüm (% 3 BSA ve 1 x PBS % 5 normal serum) engelleme kuluçkaya. Bir aspiratör ile engelleme çözümü kaldırmak ve bölümleri ile seyreltilmiş birincil antikor (Nephrin, podocin veya PECAM-1) 1:250 (1 x PBS % 3 BSA) kuluçkaya. Slaytlar bir oksijen odası 4 ° C’de gecede yerleştirin. Hafif nemli bir oda yoksa, parafilm küçük bir şerit antikor kaplı slayt yerleştirin. Bölümün engel değil olarak ertesi gün kaldırırken ilgilen. Slaytlar 3 x 5 dk 1 x PBS içinde yıkayın. -Uygun floresan ikincil antikor 1: seyreltme 1000 (1 x PBS % 3 BSA) içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 2 h ile kuluçkaya. Slaytlar 3 x 5 dk 1 x PBS içinde yıkayın. DAPI içeren ortam takma floresan ile bağlayın. Glomeruli görüntülemek için 400 X büyütme, floresan mikroskop ile görüntü slaytlar. Bu önyargı önlemek için kör emin olun. Glomerular alan ve boyama, yani, kapiller döngü sayısını desenini normalleştirilmiş boyama yoğunluk analiz etmek için kullan ImageJ glomerular alanına, kör bir şekilde normalleştirilmiş. 9. protein çıkarma ve Western blot Not: Western blot dysregulated renal hastalığı olarak bilinen ifade proteinler değerlendirmek için bize izin verir. Örneğin, podocin ve nephrin ifade bir azalma podocyte kaybı olduğunu gösterir. Protein böbrek korteks ve elenmiş glomeruli ayıklamak; her biri için aynı protokoldür ve lizis arabellek hacmi doku miktarına göre ayarlanır. Tezcan böbrek/glomeruli NP-40 lizis eklemeden önce buz üzerinde (150 mM NaCl, %1 NP-40, 50 mM Tris pH 8) içeren fosfataz ve proteaz inhibitörleri tampon. Örnek için 30 homojenize s. Homojenize örnekleri 30 dk, vortexing düzenli aralıklarla buz üzerinde kuluçkaya. Örnekleri, 10.000 x g 4 ° C’de 15 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant buz taze bir tüp için kaldırın.Not: yaklaşık 1 mg protein örnek başına kurtarmak bekliyoruz. Standart 4 x Laemmli tampon kullanarak proteinler denatüre. 95-100 ° C’de karışımı 5 dakika kaynatın. Glomerular Hücre işaretçisi proteinleri (Nephrin, Podocin, PECAM-1, vb) ve fosforilasyon ifade ve ifade bilinen/Western blot () kullanarak hastalık modeli böbrek/glomeruli değiştirilecek olan proteinlerin değerlendirmek Standart Yöntem; Mahmud ve Yang15).Not: Protokol boyutuna ve bereket protein ilgi bağlı olarak değişir. 10. RNA çıkarma ve polimeraz zincir tepkimesi (PCR) Not: mRNA ifade analizi nasıl genler gen ekspresyonu ve alternatif işlenim değişiklikler gibi böbrek hastalığında düzenlenmektedir belirlemek için bize izin verir. Böbrek korteks hala donmuş ederken iyice 3 mL fenol reaktif bir havaneli ve harç kullanarak eziyet. Glomerular özleri kullanıyorsanız, fenol reaktif 1 mL ekleyin ve örnek için 30 homojenize s.Dikkat: TRIzol reaktif: tahriş edici; duman dolapta kullanın Chomczynski ve Sacchi16tarafından açıklanan yöntemi kullanarak bir RNA ayıklama gerçekleştirmek.Not: Ticari RNA ayıklama kitleri bu yöntemi alternatif olarak mevcuttur. Miktar ve kullanılabilir çeşitli yöntemlerden birini kullanarak elde edilen RNA kalitesini değerlendirmek. RNA bu noktada bölünmemeli ve-80 ° C’de saklı. Tekrar önlemek çözülme donma.Not: bir açık 28S ve 18S ribozomal bant sağlamak için bir özel jel RNA çalıştırarak yeni Eğer bu yöntem, bir sonraki adıma devam etmeden önce RNA kalitesini kontrol. Bu yöntemi kullanarak RNA’ın 2-5 µg arasında kurtarmak bekliyoruz. DNaz tedavi RNA (RNase free su ile 10 µL artı 1 µL DNaz ve 1 µL DNaz arabelleği kadar yapmak cilt) 1 µg 1 h için 37 ° C’de DNaz durmak eriyik için 10 dk 65 ° C’de 1 µL ile reaksiyonu durdurmak. Oligo (dT) ve rasgele astar 0.5 µL ekleyin. 10 dk 70 ° C’de kuluçkaya. Hemen buz 5 min için gidermek. Aşağıdaki; MMLV ters transkriptaz enzimi (400 U; eski yerine koymak ile DEPC H2O RT – denetimi örneğini), MMLV arabellek (1 x), dNTP mix (0.5 mM) ve ribonükleaz inhibitör (40 U); DEPC su ile ilâ 50 µL olun. Reaksiyon mix 1s 95 ° C enzim devre dışı bırakmak 5 min için takip için 37 ° C’de kuluçkaya.Not: en fazla 3 saat için 37 ° C’de cDNA daha yüksek bir verim üretmek için kuluçkaya. Miktar ve cDNA bulunan çeşitli yöntemler kullanarak kalitesini değerlendirmek. Kullanım genler mRNA ifade ve yapıştırma desenleri değerlendirmek için PCR onaylanmadığına karar dysregulated glomerular hastalık modeli olmak. Protokol faiz gen bağlı olarak değişir.