A gigante Ciliophora, Stentor coeruleus, é um excelente sistema para estudar regeneração e cicatrização de feridas. Apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de culturas de células de Stentor de células únicas ou fragmentos de células, induzindo a regeneração de células de corte, quimicamente, induzindo a regeneração da banda membranellar e aparelhos orais, imagem e análise de célula regeneração.
As células precisam ser capazes de regenerar as partes para se recuperar de perturbações externas. Os ciliados unicelulares Stentor coeruleus é um organismo modelo excelente para estudar a cicatrização e regeneração celular subsequente. O genoma de Stentor tornou-se disponível recentemente, juntamente com métodos de biologia molecular moderna, tais como RNAi. Estas ferramentas possibilitam estudar regeneração de célula única a nível molecular. A primeira seção do protocolo abrange estabelecendo Stentor culturas de células de células únicas ou fragmentos de células, juntamente com as orientações gerais para a manutenção de culturas de Stentor . Cultivo de Stentor em grandes quantidades permite a utilização de ferramentas valiosas como bioquímica, sequenciamento e espectrometria de massa. As seções subsequentes do protocolo cobrem diferentes abordagens para a indução de regeneração em Stentor. Manualmente, cortando as células com uma agulha de vidro permite estudar a regeneração de partes de células grandes, enquanto o tratamento de células com sacarose ou ureia permite estudar a regeneração de estruturas específicas, localizadas na extremidade anterior da célula. Um método de imagem células individuais de regeneração é fornecido, juntamente com uma rubrica para encenar e analisar a dinâmica da regeneração. Todo o processo de regeneração é dividido em três fases. Visualizando a dinâmica da progressão de uma população de células através dos estágios, é demonstrada a heterogeneidade no calendário de regeneração.
As células não são simples sacos de enzimas, mas prefiro altamente complexas máquinas cujos componentes são cuidadosamente dimensionados para o tamanho correto e dispostos em posições bem definidas. A morfogênese das células individuais representa um processo chave em biologia celular e do desenvolvimento, mas seu mecanismo molecular é desconhecido1,2. Enquanto algumas células cultivadas assemelham-se a bolhas, organismos unicelulares podem ter extremamente complicado arquiteturas, exemplificadas pelos complexos padrões corticais vistos em ciliados3,4.
Talvez o exemplo mais extremo de uma célula altamente estruturado é Stentor coeruleus, um heterotrichous gigante ciliados parente Tetrahymena e Paramecium. Stentor é de 1 mm de comprimento e é coberto com mais de 100 listras longitudinais de pigmento azul, alternando com fileiras de cílios organizados pelo paralelas pilhas de fitas de microtúbulos que correm o comprimento da célula inteira. A célula é trombeta-dadas forma (Figura 1), com uma banda de membranellar e um aparelho oral (OA) em sua extremidade anterior e um holdfast que atribui a célula ao substrato em sua extremidade posterior. Além da polaridade claro ântero-posterior, a célula também mostra uma distintiva padronização quiral, tal que o espaçamento entre linhas ciliares gradualmente aumenta no sentido horário. Isso resulta em uma descontinuidade onde se encontra com a linha mais estreita a linha mais ampla e esta região da superfície celular, conhecida como o locus de contraste de listra, pode induzir a formação do segundo conjunto de estruturas da extremidade anterior quando enxertado em outra cela5, tornando-se formalmente equivalente ao organizador de Spemann. Assim, todos os processos-chave da biologia do desenvolvimento tem seus análogos em Stentor: axiation, formação de padrão e indução. Em um embrião, estes processos são movidos por diferenças de destino entre células diferentes, mas no Stentor, eles devem ser conduzidos por destino as diferenças entre regiões diferentes dentro de uma única célula. O que define as diferenças entre as regiões dentro Stentor é um mistério.
Se qualquer parte de Stentor é cortado, a peça que faltava da célula pode regenerar para produzir uma célula normal em questão de horas. Se uma célula é cortado na metade, ou mesmo em pedaços muito pequenos, cada peça reorganiza em uma célula de aparência normal, mas menor e restaura adequada proporcionalidade entre célula peças6,7. Mesmo pequenos fragmentos, 1/64th o tamanho da célula original, são capazes de regenerar-se em uma célula pequena, mas normalmente proporcionada e então crescer para o tamanho6. Stentor , portanto, apresenta uma oportunidade única para estudar os mecanismos da organela tamanho dimensionamento e célula crescimento Regulamento usando métodos cirúrgicos que geralmente são aplicados a nível de tecidos ou organismos todo.
Uma das propriedades de Stentor que lhe permite regenerar-se de uma ampla gama de operações cirúrgicas é que ele contém um único noduladas Macronúcleo (Figura 1), com cerca de 50.000 cópias do genoma inteiro8. Enquanto um fragmento de célula contém pelo menos um nó macronuclear, tem a capacidade de se regenerar totalmente. Outra propriedade subjacente a capacidade de regeneração do Stentoré sua prodigiosa capacidade de cicatrização de feridas. Embora muitos tipos de células são capazes de curar suas feridas9, Stentor é capaz de recuperar-se de uma extraordinária gama de perturbações físicas. Um exemplo de recuperação de Stentor de uma perturbação drástica, juntamente com os métodos para a visualização fluxo citoplasmático em Stentor10 anteriormente foram relatadas. Estes métodos permitem o estudo do efeito de regeneração como ferindo e subsequentes o estado físico do citoplasma.
Stentordo enorme tamanho, capacidade de regeneração extraordinária e o fato de que ela se manifesta de muitos dos fenômenos do desenvolvimento vistos em embriões multicelulares (como organizadores, axiation e padronização) atraíram muitos biólogos do desenvolvimento durante a virada do século passado, incluindo Thomas Hunt Morgan7. Durante os anos 50 e 60, abordagens microcirúrgicos demonstraram uma variedade surpreendente de processos regenerativos e morfogenéticas neste organismo unicelular11. No entanto, Stentor foi desenvolvido como um sistema modelo de biologia molecular apenas recentemente. Durante os últimos anos, o genoma de Stentor foi sequenciado e montados8, e o método para perturbar a expressão gênica usando RNAi alimentando foi desenvolvido12.
Uma das razões que Stentor foi desenvolvido num organismo modelo para a moderna biologia molecular só recentemente foi a dificuldade de cultivar grandes culturas devido ao seu longo ciclo de célula (3 a 5 dias). No entanto, os métodos modernos de genômica e proteômica exigem menos material do que costumavam, e o volume de uma única célula de Stentor é suficiente para estes métodos, mesmo sem recorrer a métodos ultra-sensível que foram desenvolvidos para a análise do single células que são mais pequenas que Stentor. Secção 1 do protocolo detalha o procedimento para o estabelecimento de uma grande cultura de uma única célula de Stentor . A mesma abordagem pode ser usada para estabelecer uma grande cultura de um fragmento de célula obtida pelo corte de uma célula. Secção 1 também fornece as diretrizes para a manutenção saudável Stentor culturas durante longos períodos de tempo. Secção 2 do protocolo prevê que a metodologia de indução de regeneração celular cortando as células manualmente com uma agulha de vidro. Secção 3 do protocolo é dedicado a dois métodos de induzir a regeneração de estruturas celulares específicos (aparelhos de membranellar banda e oral): tratar as células com sacarose ou ureia conduz ao derramamento destas estruturas, seguido por seus regeneração. Secção 4 do protocolo detalha um método para o tratamento de imagens de regeneração de células individuais durante longos períodos de tempo. Secção 4 termina com a descrição dos estágios de regeneração e dicas sobre a análise da dinâmica de regeneração.
Cultivo de Stentor apresenta uma série de desafios. Em primeiro lugar, para realizar experimentos que exigem um grande número de células, é necessário manter um grande número de culturas Stentor , como as culturas se tornam insalubres quando Stentor concentração excede 20 células/mL. Em segundo lugar, os organismos que podem contaminar Stentor culturas muitas vezes dividem mais rápido que Stentor e oprimem a cultura (um contaminante comum é rotíferos). Assim, é necessário verificar periodicamente o a cultura sob um microscópio e remover os contaminantes. Ocasionalmente, uma nova cultura precisa ser iniciado a partir de um pequeno número de células manualmente resgatou uma cultura contaminada. Isto aumenta o tempo necessário para se manter saudável Stentor culturas. Em terceiro lugar, expandindo uma única célula em uma cultura de 400 mL requer pelo menos um mês, porque o ciclo celular de Stentor é 3-5 dias. Em quarto lugar, ao contrário de outro modelo ciliados, Stentor raramente entram em forma de cisto e eles não podem ser congelados.
Um aspecto importante de cultivo Stentor é a seleção de um organismo de alimentação adequada. Vários métodos para cultivo Stentor foram descritos anteriormente. Um deles sugere para usar leite desnatado para bactérias de cultura que alimentam então Stentor. Tal técnica é eficaz em cultivo Stentor; no entanto, aplicação de técnicas de genômicas requer amostras puras para evitar confusões resultantes de leituras genômicas de organismos comida indefinido. Usando o protocolo atual, Stentor podem ser cultivadas em massa e, porque a comida deles, Chlamydomonas, foi sequenciada, a presença de contaminação genômica do organismo comida pode ser detectada e controlada para. Por razões desconhecidas, o tártaro tinha que reabastecer seus estoques, retornando para onde ele encontrou Stentor antes. Com o protocolo atual, fomos capazes de manter Stentor por anos.
Experimentos de regeneração com Stentor são geralmente simples, mas existem alguns detalhes importantes para manter em mente. Em relação à seção 2, corte Stentor células ao meio podem ser dominadas em minutos. Dominar os procedimentos mais avançados Microcirurgia de Stentor pode exigir uma semana de treinos. Enquanto realizando um tratamento de sacarose ou de ureia (seção 3), se no início da imagem latente, a maioria das células ainda tem suas bandas membranellar, aumentar o tempo de incubação por 10-30 s para quando o tratamento de sacarose é executado em seguida. Não aumentam o tempo de tratamento de sacarose, além de incubação de 3 min porque ele irá resultar em morte celular.
Imagem de Stentor regeneração requer métodos de grandes células de imagem durante longos períodos de tempo. O método de imagem detalhado na seção 4 só pode ser usado com um microscópio vertical. Se um microscópio invertido está disponível, em vez disso, as células podem ser colocadas em um slide ou lamela em câmaras pequenas. Um método é criar uma câmara sem vaselina e cobrir com outra lamela para evitar a evaporação. Alternativamente, uma câmara para uma célula individual pode ser feita por fazer um buraco com um furador do tamanho desejado em um 1 x 1 cm2 quadrados de espaçador de silicone (tabela de materiais), colocação do espaçador em uma lamela, colocando as células na câmara e cobrindo a câmara com outra lamela. Quando a imagem, se não vai a orientação correta para observar as características de cada etapa de regeneração Stentor , toque a placa firmemente, para fazer o contrato de célula. Assistir a célula estender para identificar o estágio de regeneração (extensão completa leva cerca de 45 s). Se a célula estiver ainda na orientação errada, repita as batidas. As imagens mostradas na Figura 1 e Figura 6 foram tiradas por um microscópio estéreo zoom; no entanto, todos os experimentos detalhados podem ser executados usando um 5 X estéreo microscópio de dissecção.
Outro desafio além de cultivo e imaging Stentor é o rastreamento de regeneração, especificamente a quantidade de tempo necessário para identificar estágios. Se a regeneração celular está perfeitamente orientado com a região do primórdio oral claramente visível, a identificação do estágio leva alguns segundos. Às vezes, no entanto, a célula de Stentor é em uma orientação impedindo a clara atribuição de fase de regeneração, tendo assim mais tempo para identificar. A quantidade significativa de tempo necessário para a fase de regeneração de células individuais podem atrasar a quantificação de todas as células em regeneração, diminuindo assim a precisão temporal do estadiamento e exigir que o observador para esperar e refazer a imagem da célula depois mudou-se para uma nova orientação. Consequentemente, esta experiência é tanto tempo e trabalho intensivo. Por estas razões, seria altamente desejável para desenvolver métodos automatizados para detectar células Stentor e atribuição de estágios de regeneração em dados de vídeo microscopia. Estas também permitiria mais experimentos reprodutíveis, aumenta o tamanho da amostra e a remoção de viés humano.
O surgimento de métodos altamente sensíveis, genômicos e proteômica, começou-se a colocar estudos de células únicas em alcance. Para tais análises de célula única, o tamanho gigante de uma célula de Stentor torna desejável cobaia para experimentos de prova de conceito. Para tais experiências ser possível, cultivo Stentor é fundamental, e então os métodos descritos aqui devem desempenhar um papel no desenvolvimento de técnicas mais avançadas de célula única.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo NIH grant R01 GM113602 (WFM) e NSF 1144247 (AL). Reconhecemos o Mark Slabodnick e Natalie Kirkland para desenvolver as versões iniciais de alguns desses protocolos e discussões informativas. Agradecemos a Karina Perlaza e Greyson Lewis pela leitura crítica do manuscrito.
Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |