Vi præsenterer her, en protokol for at rumligt og tidsligt vurdere tilstedeværelsen af levedygtige mikrobiota i kryds modet ved hjælp af en modificeret hele-mount in situ hybridisering tilgang.
Smitsomme sygdomme, der overføres af leddyr vektorer fortsætte med at udgøre en væsentlig trussel mod menneskers sundhed på verdensplan. De patogener, der forårsager disse sygdomme, eksisterer ikke isoleret, når de kolonisere vektor; snarere, de sandsynligvis engagere sig i interaktioner med hjemmehørende mikroorganismer i tarm lumen. Vektor mikrobiota har vist sig for at spille en vigtig rolle i patogen transmission for flere vektor-bårne sygdomme. Om bopæl bakterier i tarmen af Ixodes scapularis kryds, vektor af flere menneskelige patogener herunder Borrelia burgdorferi, påvirke kryds transmission af patogener er ikke fastlagt. Vi kræver metoder for kendetegner sammensætningen af bakterier forbundet med kryds tarmen til at fremme en bedre forståelse af potentielle interspecies interaktioner i kryds gut. Ved hjælp af hele-mount i situ hybridisering til at visualisere RNA udskrifter tilknyttet særlige bakteriearter giver mulighed for indsamling af kvalitative data med hensyn til forekomsten og fordelingen af mikrobiota i intakt væv. Denne teknik kan bruges til at undersøge ændringer i gut mikrobiota milieu i løbet af kryds fodring og kan også anvendes til at analysere udtryk for kryds gener. Farvning af hele kryds indvolde udbytte oplysninger om grov rumlige fordeling af target RNA i vævet uden behov for tre-dimensionelle genopbygning og påvirkes mindre af miljøforurening, der ofte tilintetgør sekventering-baseret metoder ofte brugt til at studere komplekse mikrobielle samfund. Samlet set er denne teknik et værdifuldt redskab, der kan bruges til bedre forstå vektor-patogen-mikrobiota interaktioner og deres rolle i smitteoverførsel.
Menneskelige og animalske patogener, der overføres af leddyr vektorer findes over hele verden og tegner sig for omkring 20% af smitsomme sygdomme globalt1, men effektive og sikre vacciner mod de fleste af disse patogener er ikke tilgængelige. Vores forståelse af den vigtige rolle, commensal, symbiotisk og patogene mikroorganismer, kollektivt kendt som microbiome2, i modulerende og udformningen af næsten alle metazoans3 sundhed ekspanderer. Det er nu klart, at leddyr vektorer af patogener også havnen gut mikrobiota og disse vektor-associerede mikrobiota har vist sig at påvirke forskellige vektor-bårne patogener4,5. Leddyr microbiome er sammensat af eubacteria, archaea, vira og eukaryote mikrober såsom protozoer, nematoder og svampe6. Men den fremherskende forskningsfokus har været på eubacteria skyldes, dels at tilgængeligheden af markørgener og reference databaser at identificere specifikke bakteriel medlemmer.
Med fokus på Ixodes scapularis, kryds vektor af flere menneskelige patogener herunder Borrelia burgdorferi7, , det agens af Lyme sygdom, optimering af en mikrobiel visualisering teknik var rettet mod forbedre vores forståelse af kryds gut mikrobiota i forbindelse med vektor-patogen interaktioner. Flere spørgsmål forbliver ubesvaret i feltet kryds microbiome. Tarmen er stedet for den første udvidede møde mellem kryds og indgående patogenet i forbindelse med vandret overføres patogener; Derfor vil forståelse af vektor gut mikrobiota i modulerende vektor-patogen interaktioner rolle afsløre meningsfuld indsigt. Tæger har en enestående tilstand af blodmel fordøjelsen, hvor behandlingen af blodmel komponenter finder sted intracellulært8. Tarm lumen tilsyneladende fungerer som et fartøj indeholder blod måltid som tick feeds, og næringsstof fordøjelse og assimilation opstå i hele flere dage af fodring og fortsætte efter repletion. Patogener erhvervet af kryds under fodring Angiv tarm lumen sammen med blodmel og dermed lumen bliver en primære websted af interaktioner mellem kryds, patogen og bosiddende mikrobiota. Som fordøjelse provenuet gennem repletion og Ixodid kryds molting, gennemgår gut strukturelle og funktionelle ændringer9. Sammensætning og den rumlige organisering af tarm bakterier er også tilbøjelige til at variere i koncert med de skiftende gut milieu. Det er derfor vigtigt at forstå arkitekturen i resident bakterier i kryds tarm til fuldt ud at forstå samspillet mellem kryds, patogen og gut mikrobiota.
Molekylære teknikker til at beskrive vært-associerede mikrobiota rutinemæssigt udnytte høj overførselshastighed parallelle sekventering strategier10 for at forstærke og sekvens bakteriel 16S ribosomale DNA (rDNA). Disse sekventering strategier omgå nødvendigheden af at opnå axenic kulturer af specifikke bakterier og giver en detaljeret beskrivelse af alle bakteriel medlemmer repræsenteret i stikprøven. Sådanne strategier er dog forvirret af manglende evne til at skelne mellem miljømæssige forureninger fra Bonafide beboere. Yderligere, når vurderingen af prøver, som flåter, som er små i størrelse og dermed indeholder lav mikrobiota-specifikke DNA udbytter, sandsynligheden for forstærkning af miljøforurenende er øget11 og resultater i den tvetydige fortolkning af Microbiome sammensætning. Funktionelle karakterisering i forbindelse med visualisering af specifikke levedygtige bakterier vil derfor være afgørende at definere og skelne microbiome af kryds, tidsmæssigt og rumligt. Mod dette mål tog vi fordel af hele-mount RNA i situ hybridisering. Denne teknik bruges rutinemæssigt til at vurdere gen expression mønstre i organer og embryoner12,13,14 og giver mulighed for semikvantitativ analyse af udtryk over hele prøven af interesse. Dette adskiller sig fra traditionelle i situ hybridisering teknikker, der anvender væv sektioner og ofte kræver omfattende analyse af sektioneret materiale med en beregningsmæssige forsamling at forudsige udtryk i hele organer15. Mens hele-mount generelt henviser til hele organismer12, refererer her hele-mount til hele indvolde eller organer. Fordelene ved at bruge hele-mount RNA i situ hybridisering tilgang til at vurdere arkitektur af kryds gut mikrobiota er multifold. Kryds gut er sammensat af 7 par af Divertikler, hvert par varierende i størrelse16. Den funktionelle forskelle, kryds hvis nogen blandt disse Divertikler, ikke er forstået i forbindelse med kryds biologi, mikrobiota eller kryds-patogen interaktioner. Manipulationer af tarmen, at briste gut Divertikler vil fortrænge mikrobiota stede i tarm lumen eller dem løst tilknyttet gut og fører til fejlfortolkning af den geografiske lokalisering af mikrobiota. Fluorescens-mærket RNA i situ hybridisering er blevet udnyttet tidligere for at undersøge kryds gut udskrifter17 ved fastsættelse og åbne individuelle gut diverticula at sikre sonde hybridisering og lokalisere B. burgdorferi udskrifter af skæring paraffin-embedded hele flåter18. Begge disse metoder kræver manipulationer af kryds væv inden hybridisering, der ville påvirke gut mikrobiota arkitekturen.
I denne betænkning beskriver vi i detaljer protokollen for at undersøge levedygtige kryds gut mikrobiota bruger hele-mount i situ hybridisering (WMISH). Brug af hele-mount RNA i situ hybridisering muliggør en global forståelse af tilstedeværelsen og overflod af specifikke tarm bakterier i de forskellige regioner i tarmen og kan anspore til nye indsigter i kryds gut biologi i forbindelse med patogenet kolonisering og transmission. Yderligere, brugen af RNA-sonder rettet mod specifikke bakterielle RNA giver mulighed for påvisning af levedygtige bakterier i kryds gut.
Dette er den første brug af en helhed-mount i situ hybridisering (WMISH) teknik til at studere mikrobiota af en leddyr vektor af patogener. Vores protokol blev tilpasset fra en bruges til at undersøge udviklingen i Drosophila og frøen embryoner25,26. Hele-mount RNA i situ hybridisering har været rutinemæssigt anvendes til at lokalisere gen udskrifter rumligt og tidsligt27 og visualisering af udskrifter kan g…
The authors have nothing to disclose.
Vi takke oprigtigt Dr. Mustafa Khokha, Yale University, for at give brugen af hans laboratorium ressourcer. Vi er taknemmelige for Mr. Ming-Jie Wu fremragende teknisk bistand. EF er en HHMI investigator. Dette arbejde blev støttet af en gave fra John Monsky og Jennifer Weis Monsky Lyme Disease Research Fund.
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
#11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
Light box | VWR | 102097-658 | |
PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |