Visualisering af mikrobiota i kryds tarme af hele-mount In Situ hybridisering

Menneskelige og animalske patogener, der overføres af leddyr vektorer findes over hele verden og tegner sig for omkring 20% af smitsomme sygdomme globalt¹, men effektive og sikre vacciner mod de fleste af disse patogener er ikke tilgængelige. Vores forståelse af den vigtige rolle, commensal, symbiotisk og patogene mikroorganismer, kollektivt kendt som microbiome², i modulerende og udformningen af næsten alle metazoans³ sundhed ekspanderer. Det er nu klart, at leddyr vektorer af patogener også havnen gut mikrobiota og disse vektor-associerede mikrobiota har vist sig at påvirke forskellige vektor-bårne patogener^4,5. Leddyr microbiome er sammensat af eubacteria, archaea, vira og eukaryote mikrober såsom protozoer, nematoder og svampe⁶. Men den fremherskende forskningsfokus har været på eubacteria skyldes, dels at tilgængeligheden af markørgener og reference databaser at identificere specifikke bakteriel medlemmer.

Med fokus på Ixodes scapularis, kryds vektor af flere menneskelige patogener herunder Borrelia burgdorferi⁷, , det agens af Lyme sygdom, optimering af en mikrobiel visualisering teknik var rettet mod forbedre vores forståelse af kryds gut mikrobiota i forbindelse med vektor-patogen interaktioner. Flere spørgsmål forbliver ubesvaret i feltet kryds microbiome. Tarmen er stedet for den første udvidede møde mellem kryds og indgående patogenet i forbindelse med vandret overføres patogener; Derfor vil forståelse af vektor gut mikrobiota i modulerende vektor-patogen interaktioner rolle afsløre meningsfuld indsigt. Tæger har en enestående tilstand af blodmel fordøjelsen, hvor behandlingen af blodmel komponenter finder sted intracellulært⁸. Tarm lumen tilsyneladende fungerer som et fartøj indeholder blod måltid som tick feeds, og næringsstof fordøjelse og assimilation opstå i hele flere dage af fodring og fortsætte efter repletion. Patogener erhvervet af kryds under fodring Angiv tarm lumen sammen med blodmel og dermed lumen bliver en primære websted af interaktioner mellem kryds, patogen og bosiddende mikrobiota. Som fordøjelse provenuet gennem repletion og Ixodid kryds molting, gennemgår gut strukturelle og funktionelle ændringer⁹. Sammensætning og den rumlige organisering af tarm bakterier er også tilbøjelige til at variere i koncert med de skiftende gut milieu. Det er derfor vigtigt at forstå arkitekturen i resident bakterier i kryds tarm til fuldt ud at forstå samspillet mellem kryds, patogen og gut mikrobiota.

Molekylære teknikker til at beskrive vært-associerede mikrobiota rutinemæssigt udnytte høj overførselshastighed parallelle sekventering strategier¹⁰ for at forstærke og sekvens bakteriel 16S ribosomale DNA (rDNA). Disse sekventering strategier omgå nødvendigheden af at opnå axenic kulturer af specifikke bakterier og giver en detaljeret beskrivelse af alle bakteriel medlemmer repræsenteret i stikprøven. Sådanne strategier er dog forvirret af manglende evne til at skelne mellem miljømæssige forureninger fra Bonafide beboere. Yderligere, når vurderingen af prøver, som flåter, som er små i størrelse og dermed indeholder lav mikrobiota-specifikke DNA udbytter, sandsynligheden for forstærkning af miljøforurenende er øget¹¹ og resultater i den tvetydige fortolkning af Microbiome sammensætning. Funktionelle karakterisering i forbindelse med visualisering af specifikke levedygtige bakterier vil derfor være afgørende at definere og skelne microbiome af kryds, tidsmæssigt og rumligt. Mod dette mål tog vi fordel af hele-mount RNA i situ hybridisering. Denne teknik bruges rutinemæssigt til at vurdere gen expression mønstre i organer og embryoner^12,13,14 og giver mulighed for semikvantitativ analyse af udtryk over hele prøven af interesse. Dette adskiller sig fra traditionelle i situ hybridisering teknikker, der anvender væv sektioner og ofte kræver omfattende analyse af sektioneret materiale med en beregningsmæssige forsamling at forudsige udtryk i hele organer¹⁵. Mens hele-mount generelt henviser til hele organismer¹², refererer her hele-mount til hele indvolde eller organer. Fordelene ved at bruge hele-mount RNA i situ hybridisering tilgang til at vurdere arkitektur af kryds gut mikrobiota er multifold. Kryds gut er sammensat af 7 par af Divertikler, hvert par varierende i størrelse¹⁶. Den funktionelle forskelle, kryds hvis nogen blandt disse Divertikler, ikke er forstået i forbindelse med kryds biologi, mikrobiota eller kryds-patogen interaktioner. Manipulationer af tarmen, at briste gut Divertikler vil fortrænge mikrobiota stede i tarm lumen eller dem løst tilknyttet gut og fører til fejlfortolkning af den geografiske lokalisering af mikrobiota. Fluorescens-mærket RNA i situ hybridisering er blevet udnyttet tidligere for at undersøge kryds gut udskrifter¹⁷ ved fastsættelse og åbne individuelle gut diverticula at sikre sonde hybridisering og lokalisere B. burgdorferi udskrifter af skæring paraffin-embedded hele flåter¹⁸. Begge disse metoder kræver manipulationer af kryds væv inden hybridisering, der ville påvirke gut mikrobiota arkitekturen.

I denne betænkning beskriver vi i detaljer protokollen for at undersøge levedygtige kryds gut mikrobiota bruger hele-mount i situ hybridisering (WMISH). Brug af hele-mount RNA i situ hybridisering muliggør en global forståelse af tilstedeværelsen og overflod af specifikke tarm bakterier i de forskellige regioner i tarmen og kan anspore til nye indsigter i kryds gut biologi i forbindelse med patogenet kolonisering og transmission. Yderligere, brugen af RNA-sonder rettet mod specifikke bakterielle RNA giver mulighed for påvisning af levedygtige bakterier i kryds gut.