זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay
Summary
כאן, אנו מראים כיצד להשתמש Assay מצדו קרבה (PLA) כדי להמחיש את MST1/MST2 heterodimerization בתאים קבוע עם רגישות גבוהה.
Abstract
אינטראקציות חלבון מוסדר כעיקרון המנחה לאירועים איתות רבים, זיהוי אירועים כאלה הוא מרכיב חשוב בהבנת כמה מסלולים כאלה מאורגנים, כיצד הן פועלות. ישנן שיטות רבות לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים, אבל יחסית מעטים ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציות בין חלבונים אנדוגני. אחד שיטה כזו, הקרבה מצדו וזמינותו (PLA), יש מספר יתרונות להמליץ על השימוש בו. לעומת שיטות נפוצות אחרות של ניתוח אינטראקציית חלבון-חלבון, פלה יש רגישות גבוהה יחסית, ניתן לבצע עם מניפולציה תא מינימלי, ו, ב פרוטוקול המתוארים בזאת, מחייב רק שני במטרה נוגדנים נגזר מינים שונים (למשל., עכבר, ארנב), ריאגנט מתמחה אחד: ערכה של נוגדנים משניים שאינם oligonucleotides covalently מקושר ספציפי זה, הביאה בסמיכות אחד לשני, ליצור פלטפורמת amplifiable בחיי עיר PCR או מתגלגל מעגל ההגברה. במצגת זו, אנו מציגים כיצד ליישם את הטכניקה PLA להמחיש שינויים בסמיכות MST1 ו- MST2 בתאים קבוע. בטכניקה המתוארת בכתב היד ישימה במיוחד לניתוח של התא איתות מחקרים.
Introduction
שיבוש MST1/היפו איתות חובר ל הפרעות התפתחותיות carcinogenesis1. ביונקים, להפעיל kinases MST1 ו- MST2 (phosphorylate) MOB1 ו- LATS1/2, הצופות על phosphorylates ואז חלבונית תעתיק שיתוף activator חלבונים הקשורים כן (הפה)2. (Unphosphorylated) בצורתו הפעילה, הפה יש פעילות oncogenic, שיפור שעתוק של גנים התפשטות תאים; לעומת זאת, כאשר הפה הוא מומת על ידי השביל היפו, התפשטות תאים מדוכא, אפופטוזיס בדרגה3. ברקמות, MST1 ו- MST2 קיים בעיקר בתור homodimers פעיל, אבל גירויים oncogenic יכול להגביר את רמות של MST1/MST2 heterodimers, ויש כאלה heterodimers לא פעיל4. עם זאת, כמה heterodimerization MST1/MST2 מוסדר נשאר ממעטים להבין. גם הומו – וגם heterodimers הם בתיווך דרך אינטראקציות בין C-מסוף סליל מפותל מחוזות MST1 MST2 הידועה בשם שרה תחומים5. באמצעות יישום בחיי עיר PLA הפגינו במאמר זה, נוכל להציג את הנוכחות של MST1/MST2 heterodimers בתאים תאי שוואן אנושי (HSC) וכליות עובריים אנושיים (HEK-293). PLA יש יתרון על פני אחרים/חלבון עצבו זיהוי משום שהיא מאפשרת הגילוי של אינטראקציות חלבון אנדוגני, אשר ניתן לזהות לכמת ללא הצורך של ביטוי transgene או את השימוש epitope תגיות 6.
התמרה חושית איתות המסלולים נשלטים במידה רבה על ידי האגודה מותנה של רכיב חלבונים. לדוגמה, גירוי של רוב קולטן טירוזין kinases מוביל שלהם הומו – או הטרו-dimerization הבאים שיוך נוספים חלבונים איתות תאיים, אשר עצמם מתחמי טופס נוסף. המטרה של שיטת ה-PLA היא להמחיש את הקרבה בין סוגי החלבונים בתאים, ובלבד החלבונים נמצאים פחות מ 30-40 ננומטר בנפרד. חלבון קרבה לרוב מאותרים על ידי הראשון המקננת התאים עם נוגדנים הראשי המתאים העולות מינים שונים (למשל., ראביט, עכבר) נגד כל חלבון אינטראקציה, ואז הוספת נוגדנים תלויי מין משניים, DNA מראש בשילוב כדי קצר רגשים. אם הגששים DNA בסמיכות, oligonucleotide דנ א קישור ספציפי באפשרותך לאגוד בו זמנית הן של אלה הגששים, ויצרו פלטפורמה עבור הגברה באמצעות בחיי עיר PCR או על ידי גלגול מנגנון מעגל. תגיות פלורסנט נוספו התגובה הגברה לאפשר ויזואליזציה של החלבונים אינטראקציה, אשר מופיעים כנקודות פלורסנט שניתן בקלות לכמת או מקומית אזורים מסוימים ב-7,תא8, 9 , 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
מצאנו את זה שימושי כדי להשתמש זכוכית קאמרית שקופיות עבור הניסוי זה מאוד נוח לבצע ניסוי עם מספר שורות תאים (14-16), אין צורך לשנות את הדגימה בכל פעם במהלך ניתוח מיקרוסקופ. כמה סיבוכים שעלולים להתעורר, כגון סיכון מוגבר זיהום, עם נוגדנים. לכן, אנו ממליצים לשטוף כל טוב בנפרד במקום להשתמש צנצנת Coplin, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים המעבדה Chernoff כל תורם אופטימיזציה של אימות של פרוטוקול זה, מריה ראדו, גלינה Semenova מסוים. אנו מודים גם אנדריי Efimov מתקן הדמיה תא ב- Fox Chase Cancer Center. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH (R01 CA148805) לשם פורשים.
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
Referências
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
- Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
- Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
- Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
- Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
- Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
