Skörda Venom gifter från Assassin buggar och andra Heteropteran insekter
Summary
Även om många insekter i underordningen halvvingar (Insecta: Hemiptera) är giftig, venom sammansättningen och funktioner i deras venom toxiner är mestadels okända. Det här protokollet beskriver metoder för att skörda heteropteran serotoninreceptorerna för ytterligare karakterisering, med elektrostimulering, trakasserier och körtel dissektion.
Abstract
Heteropteran insekter såsom assassin buggar (Reduviidae) och jätte vatten buggar (Belostomatidae) härstammar från en gemensam förfader för predaceous och giftig, och majoriteten av bevarade heteropterans behålla denna trofiska strategi. Vissa heteropterans har övergått till utfodring på ryggradsdjur blod (såsom kysser buggar, Triatominae; och vägglöss, Cimicidae) medan andra har återgått till livnär sig på växter (de flesta Pentatomomorpha). Dock är med undantag av saliv som används av kysser fel för att underlätta blod-utfodring, lite känt om heteropteran serotoninreceptorerna jämfört med serotoninreceptorerna spindlar, skorpioner och ormar.
Ett hinder för karakterisering av heteropteran venom gifter är struktur och funktion i venom/labial körtlar, som både morfologiskt komplexa och utföra flera biologiska roller (försvar, prey capture och extra oral matsmältningen). I den här artikeln beskriver vi tre metoder vi har framgångsrikt använt att samla heteropteran serotoninreceptorerna. Först presenterar vi elektrostimulering som ett bekvämt sätt att samla venom som ofta är dödliga när injiceras i prey djuren, och som undanröjer kontaminering av körtelvävnad. För det andra visar vi att mild trakasserier av djur är tillräcklig för att producera giftet extrudering från Snabel eller venom spotta i vissa grupper av heteropterans. För det tredje, vi beskriva metoder för att skörda venom toxiner genom dissektion av bedövat djur att få venom körtlar. Denna metod är komplement till andra metoder, som det kan tillåta skörd av toxiner från taxa där elektrostimulering och trakasserier är ineffektiva. Dessa protokoll kommer att ge forskarna möjlighet att skörda gifter från heteropteran insekter för struktur och funktion karakterisering och möjliga tillämpningar inom medicin och jordbruk.
Introduction
Heteropteran serotoninreceptorerna är potent bioaktiva ämnen1. Venom/saliv sekret från blod-utfodring halvvingar som kysser fel (Triatominae) och vägglöss (Cimicidae) underlättar till exempel utfodring genom att störa hemostas2. Gifter i dessa serotoninreceptorerna rikta flera vägar, inklusive koagulering, trombocytaggregation och vasokonstriktion, samt smärta och kliar vägar. Serotoninreceptorerna från de flesta andra heteropteran arter är anpassade för att underlätta predation snarare än blod-utfodring. Deras serotoninreceptorerna orsaka förlamning, död eller vävnad kondensering när injiceras i ryggradslösa djur3,4. När injiceras i ryggradsdjur, kanske också giftet drastiska effekter. Injektion av giftet från assassin bugg Holotrichius innesi till ryggradsdjur orsakar exempelvis smärta, muskelförlamning och blödning; möss envenomated av denna bugg dör snabbt på grund av andningsförlamning5.
Transcriptomic och proteomiska studier visat protein sammansättningen av vissa heteropteran serotoninreceptorerna. Serotoninreceptorerna predaceous arter är rika på proteaser, andra enzymer, och peptider och proteiner av okänd struktur och funktion6,7,8. Kyssas bugg venom är rik på familjen triabin protein, vars medlemmar djupt påverka koagulering, trombocytaggregation och vasokonstriktion2,9. Det är dock inte känt vilka gifter ligger bakom de flesta bioactivities av venom. Till exempel venom kysser fel Triatoma infestans har rapporterats vara smärtstillande och hämmar natrium kanaler10, men komponenterna ansvarig återstår belysas. Likaså är det inte känt vilka komponenter av assassin bugg venom orsaka förlamning eller smärta. En förutsättning för att identifiera de ansvariga för särskilda venom bioactivities och karaktärisera struktur och funktion av romanen venom toxiner, gifterna är att erhålla venom.
Venom har erhållits från heteropterans av elektrostimulering5,6,7,8,11,12,13, provokation av defensiv svar4,8, mekaniskt klämma på thorax12,14,15,16, dissekera ut venom körtlar8,17 ,18,19,20,21,22, och tillämpningen av agonister av muskarina acetylkolin receptor23. Att döma av de potentiella fördelar och nackdelar med varje metod kompliceras av morfologi av heteropteran venom körtlar, som består av en viktigaste körtel med två separata lumen, den främre viktigaste körtel (AMG) och bakre viktigaste körtel (PMG), samt en associerade tillbehör körtel (AG). Dessa olika körtel avdelningar producerar olika protein sekret, som kan vara specialiserade för olika biologiska funktioner såsom byte capture, försvar och extra oral matsmältningen8,17. I peiratine och ectrichodiine assassin buggar, har AMG associerats med prey avskiljning och PMG med extra oral matsmältningen17. Dock i harpactorine är bugg Pristhesancus plagipennis PMG specialiserad för byte fånga och matsmältningen medan AMG är hypotesen för att utsöndra defensiva venom8. AG har beskrivits som att ha lite sekretoriska funktion i assassin buggar8 eller som en större webbplats proteas lagring i giant vatten buggar23. Tydligt, krävs ytterligare arbete att klargöra funktionen av varje körtel fack bland olika heteropteran undergrupper, och att avgöra funktionen av de flesta venom toxiner. I denna rapport beskriver vi protokoll för skörd venom gifter från heteropterans mot detta mål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest kritiska steget i skörd assassin bugg venom är att välja lämplig metod beroende på tillämpningen av studien. Var och en av de tre metoder som presenteras för skörd heteropteran serotoninreceptorerna har fördelar och nackdelar beroende på nedströms tillämpningar.
Inducerande buggar att utvisa giftet från proboscis (protokoll 1-3) undviker förorening av venom av glandular vävnad. Dessutom, dessa metoder är icke-dödliga och kan upprepas många gånger under loppet av ett…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner finansiellt stöd från det australiska forskningsrådet (bidrag DP130103813 och LP140100832 till G.F.K., DECRA gemenskap DE160101142 till Ekström), Australian National Health & Medicinska forskningsrådet (huvudsakliga Research Fellowship APP1044414 till G.F.K.), och University of Queensland (postdoktorsstipendium till Arnauld).
Materials
| Electostimulator | Grass Technologies | S48 Square Pulse Stimulator | Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation |
| Featherlight tweezers | Australian Entomological Supplies | E122B | For handling live venomous insects |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | 4693124001 | For preventing autoproteolytic digestion of venom |
| Dissection equipment | Australian Entomological Supplies | E152Micro | For fine dissections |
| Insect pins | Australian Entomological Supplies | E162 | For fine dissections |
Referências
- Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43 (2016).
- Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera. Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).
- Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae). Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).
- Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
- Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A., Kaiser, E. . Animal and Plant Toxins. , 143-146 (1973).
- Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
- Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755 (2018).
- Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44 (2016).
- Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).
- Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization. FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).
- Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids. Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).
- Silva-Cardoso, L., et al. Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum. Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).
- Noeske-Jungblut, C., et al. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin. Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).
- Noeske-Jungblut, C., et al. An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).
- Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
- Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae). Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).
- Maran, S. P. M., Ambrose, D. P., Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. . Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , 125-131 (2000).
- Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P., Ambrose, D. P. . Insect Pest Management, A Current Scenario. , 346-361 (2011).
- Pereira, M. H., et al. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).
- Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).
- Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).
- Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).
- Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. On the ‘spitting’ behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae). Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).
- Fink, L. S. Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae). Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).
- Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
- Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).
