Oogsten van Venom toxines uit Assassin insecten en andere Heteropteran insecten
Summary
Hoewel veel insecten in de onderorde Wantsen (Insecta: Hemiptera) zijn giftig, de samenstelling van hun gif en de functies van hun vergift toxinen zijn meestal onbekend. Dit protocol wordt beschreven methoden om te heteropteran boosdoeners voor verdere karakterisering, met behulp van elektrostimulatie, intimidatie en klier dissectie van de oogst.
Abstract
Heteropteran insecten zoals assassin bugs (Reduviidae) en reus water bugs (Belostomatidae) stamde uit een gemeenschappelijke voorouder van de predaceous en giftige, en de meerderheid van de overgeleverde heteropterans behouden deze trofische strategie. Sommige heteropterans zijn overgestapt naar het eten van gewervelde bloed (zoals de kissing bugs, Triatominae; en bed bugs, Cimicidae) terwijl anderen zijn teruggekeerd naar het eten van planten (de meeste Pentatomomorpha). Echter, met uitzondering van speeksel door kussende bugs gebruikt om bloed-voeding, weinig is bekend over heteropteran boosdoeners in vergelijking met het gif van spinnen, schorpioenen en slangen.
Een obstakel voor de karakterisatie van heteropteran venom toxines is de structuur en functie van de venom/labiaal klieren, die beide morfologisch complexe en uitvoeren van meerdere biologische functies (defensie, prooi vangen en extra mondelinge spijsvertering). In dit artikel beschrijven we drie methoden die we met succes gebruikt hebben voor het verzamelen van heteropteran boosdoeners. Eerst presenteren we elektrostimulatie zoals een handige manier voor het verzamelen van gif dat is vaak dodelijk wanneer geïnjecteerd in prooi dieren en die besmetting door klierweefsel ondervangt. Ten tweede, we laten zien dat zachte intimidatie van dieren volstaat om GIF extrusie van de proboscis en/of GIF spugen in sommige groepen van heteropterans. Ten derde, beschrijven we methoden om te oogsten venom toxines door dissectie van verdoofde dieren te verkrijgen van de venom klieren. Deze methode is een aanvulling op andere methoden, zoals het kunnen oogsten van toxine van taxa waarin elektrostimulatie en intimidatie ineffectief zijn. Deze protocollen kunnen onderzoekers te oogsten van toxine van heteropteran insecten voor structuur-functie karakterisatie en mogelijke toepassingen in geneeskunde en landbouw.
Introduction
Heteropteran boosdoeners zijn krachtig bioactieve stoffen1. Bijvoorbeeld, de afscheidingen van de venom/speeksel van Wantsen bloed-voeding zoals kussende bugs (Triatominae) en bed bugs (Cimicidae) vergemakkelijkt voeden door het verstoren van hemostase2. Giftige stoffen in deze boosdoeners richten op meerdere trajecten met inbegrip van coagulatie, aggregatie van de bloedplaatjes en vasoconstrictie, evenals de pijn en jeuk van de trajecten. Boosdoeners van de meeste andere soorten heteropteran zijn aangepast om predatie in plaats van bloed-voeding. Hun boosdoeners veroorzaken verlamming, dood en weefsel vloeibaar maken wanneer geïnjecteerd in ongewervelden3,4. Wanneer geïnjecteerd in gewervelde dieren, kan hun gif ook drastische gevolgen hebben. Bijvoorbeeld veroorzaakt injectie van GIF van de moordenaar bug Holotrichius innesi in gewervelde dieren pijn, verlamming van de spieren en bloeding; muizen envenomated door deze bug sterven snel als gevolg van respiratoire verlamming5.
Transcriptomic en Proteoom studies is de samenstelling van de eiwitten van sommige heteropteran boosdoeners gebleken. Boosdoeners predaceous soorten zijn rijk aan proteasen, enzymen, en peptides en proteïnen van onbekende structuur en functie van6,7,8. Kissing bug venom is rijk aan de triabin eiwit familie, waarvan de leden diep coagulatie, aggregatie van bloedplaatjes en vasoconstrictie2,9 beïnvloeden. Het is echter niet bekend welke toxines ten grondslag liggen aan de meeste bioactivities van venom. Bijvoorbeeld GIF van de kissing bug Triatoma infestans pijnstiller en remmen natrium kanalen10heeft gemeld, maar de onderdelen die verantwoordelijk blijven om te worden opgehelderd. Het is ook niet bekend welke onderdeel van assassin bug venom dat verlamming of pijn veroorzaken. Een voorwaarde voor het identificeren van de toxines verantwoordelijk voor bepaalde venom bioactivities en voor het karakteriseren van de structuur en functie van roman venom toxines, is het verkrijgen van venom.
Venom is verkregen van heteropterans door elektrostimulatie5,6,7,8,11,12,13, provocatie van defensief Reacties4,8, mechanisch knijpen de thorax12,14,15,16, ontleden uit venom klieren8,17 ,18,19,20,21,22, en toepassing van agonisten van de muscarinerge acetylcholine receptor23. Beoordelen van de mogelijke voor- en nadelen van elke methode wordt bemoeilijkt door de morfologie van heteropteran venom klieren, die bestaan uit een belangrijkste wartel met twee aparte lumen, de anterior belangrijkste klier (AMG) en de achterste belangrijkste klier (PMG), evenals een bijbehorende klier accessoire (AG). Deze verschillende klier compartimenten produceren verschillende eiwit afscheidingen, die kunnen worden gespecialiseerd voor verschillende biologische functies, met inbegrip van prooi vangen, defensie en extra mondelinge spijsvertering8,17. In peiratine en ectrichodiine assassin bugs, heeft de AMG gepaard met prooi vangen en de PMG met extra mondelinge spijsvertering17. Echter in de harpactorine is bug Pristhesancus plagipennis de PMG gespecialiseerd prooi vangen en de spijsvertering overwegende dat de AMG is veronderstelde om defensieve venom8afscheiden. De AG is bestempeld als zijnde weinig secretoire functie in assassin bugs8 of als een belangrijke site voor protease storage in reus water bugs23. Het is duidelijk dat verdere werkzaamheden vereist ter verduidelijking van de functie van elk compartiment van de klier onder diverse subgroepen van de heteropteran en voor het bepalen van de functie van de meeste GIF toxines. In dit rapport beschrijven we protocollen voor het oogsten van venom toxines uit heteropterans richting van dit doel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stap in het oogsten van assassin bug venom is het selecteren van de juiste methode afhankelijk van de toepassing van de studie. Elk van de drie methoden voorgesteld voor het oogsten van heteropteran boosdoeners heeft voordelen en nadelen afhankelijk van downstream toepassingen.
Inducerende bugs te verdrijven van GIF van de proboscis (protocollen 1-3) dat verontreiniging van venom voorkomen wordt door klierweefsel weefsels. Bovendien, deze methoden zijn niet-letale en kunnen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de financiële ondersteuning van de Australian Research Council (subsidies DP130103813 en LP140100832 naar G.F.K., DECRA Fellowship DE160101142 naar EABU), de Australische National Health & Medical Research Council (Principal Research Fellowship APP1044414 naar G.F.K.), en de Universiteit van Queensland (postdoctorale Fellowship aan A.A.W.).
Materials
| Electostimulator | Grass Technologies | S48 Square Pulse Stimulator | Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation |
| Featherlight tweezers | Australian Entomological Supplies | E122B | For handling live venomous insects |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | 4693124001 | For preventing autoproteolytic digestion of venom |
| Dissection equipment | Australian Entomological Supplies | E152Micro | For fine dissections |
| Insect pins | Australian Entomological Supplies | E162 | For fine dissections |
Referências
- Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43 (2016).
- Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera. Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).
- Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae). Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).
- Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
- Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A., Kaiser, E. . Animal and Plant Toxins. , 143-146 (1973).
- Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
- Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755 (2018).
- Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44 (2016).
- Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).
- Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization. FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).
- Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids. Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).
- Silva-Cardoso, L., et al. Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum. Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).
- Noeske-Jungblut, C., et al. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin. Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).
- Noeske-Jungblut, C., et al. An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).
- Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
- Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae). Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).
- Maran, S. P. M., Ambrose, D. P., Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. . Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , 125-131 (2000).
- Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P., Ambrose, D. P. . Insect Pest Management, A Current Scenario. , 346-361 (2011).
- Pereira, M. H., et al. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).
- Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).
- Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).
- Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).
- Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. On the ‘spitting’ behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae). Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).
- Fink, L. S. Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae). Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).
- Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
- Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).
