成像 Ca^{2 +}在志贺菌感染上皮细胞期间的响应

Ca^{2 +}调节所有已知的单元进程, 包括骨架重组、炎症反应和与宿主-病原体相互作用有关的细胞死亡通路^1,2,3。在生理条件下, 基底胞浆 Ca^{2 +}浓度低, 在数以百计的 nM 范围内, 但可能会受到瞬变增加后激动剂刺激。这些变化经常表现出振荡行为, 通过泵和渠道在血浆和内质网膜的作用。这些振荡的模式以 ca^{2 +}的周期、持续时间和振幅为特征, 并由单元格进行解密, 然后在被称为 Ca^{2 +}代码^4,5 中触发特定响应..在病理条件下, 胞浆 Ca^{2 +}浓度的持续增加可能导致与线粒体膜通透相关的细胞死亡, 并释放亲凋亡或坏死因子^{6, 7}。

志贺菌是细菌性痢疾的致病剂, 通过使用 III. 型分泌系统 (T3SS)^8、9, 将效应器注入宿主细胞, 侵入上皮细胞。志贺菌入侵宿主单元格与 T3SS 引发的本地和全局 Ca^{2 +}信号相关联。至于成孔毒素, T3SS translocon 插入宿主细胞膜, 并需要注入 T3SS 效应剂可能负责激活 PLC 和肌醇 (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3) 依赖 Ca^{2 +}释放。局部 PLC 刺激和聚合肌动蛋白在志贺菌入侵部位的聚集, 导致超持久的 InsP3-dependent Ca^{2 +}发行¹⁰。III. 型效应器 IpgD, 磷脂 45 bisphosphate (PIP2)-4-磷酸酶, 限制了局部 PIP2 量, 从而控制了可编程序控制器生成 InsP3 的可用基板的数量, 这有助于限制本地 Ca^{2 +}细菌入侵站点的响应^11,12。这些本地 Ca^{2 +}响应可能会导致在志贺菌入侵站点¹⁰的肌动蛋白聚合。但是, 由志贺氏引起的全局 Ca^{2 +}响应是细菌入侵过程不可缺少的, 但会触发连接蛋白 hemichannels 在等离子膜上的打开和胞外 ATP 的释放。车厢。以分泌方式释放的 ATP 将反过来刺激受感染细胞旁边的单元格中的 Ca^{2 +}振荡响应。IpgD 还负责将全局 Ca^{2 +}响应塑造为不稳定的孤立响应, 并具有缓慢的动态。最后, 在长时间的细菌感染后, IpgD 导致 InsP3-mediated Ca^{2 +}信号的抑制。通过对 ca^{2 +}信号的干扰, IpgD 延迟了与 ca^{2 +}相关的钙蛋白酶激活, 导致了焦点黏附结构的拆卸和感染细胞的过早脱离 13.

虽然 Ca^{2 +}信号涉及病机的关键方面, 但微生物的使用引发了一些在经典激动剂研究中没有遇到的技术挑战。此处描述的协议使用常用的荧光 Ca^{2 +}化学指标 Fluo-4, 我们在志贺病毒感染期间设计了用于表征本地 Ca^{2 +}信号的特性。讨论了对这些信号进行检测的关键步骤, 以及为进行定量分析所需的程序, 以确定细菌效应在 Ca^{2 +}信号中的作用。